1、 ICS 65.020.30 B 43 备案号：48513-2016 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 14362015 藏羊细管冷冻精液生产技术规程 2015-12-21 发布 2016-03-20 实施 青海省质量技术监督局 发布 DB63/T 14362015 I 前 言 本规程的编写符合GB/T 1.1-2009的规则。 本规程由青海省农牧厅提出并归口。 本规程起草单位：青海省家畜改良中心。 本规程主要起草人：马元梅、张晋青、胡宁玺、常永梅、莫延新、赵静、袁海洲、张子安、谢秀梅、 李强、张金梅、杨玉芹、扈添琴、王芳、李景、池胜刚、谭建宁。 DB63/T 14362015 1 藏
2、羊细管冷冻精液生产技术规程 1 范围 本规程规定了欧拉型、高原型、山谷型藏羊细管冻精生产的基本要求、稀释液配制、采精、精液处 理、精液冷冻、冻精活力检验规则和方法、冻精质量评价、冻精包装、标记和贮存等。 本规程适用于藏羊的细管冷冻精液的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 1234 牛冷冻精液生产技术规程 3 术语与定义 以下术语和定义适用于本规程。 3.1 采精 用人
3、工模拟的器械获得公羊精液的方法。 3.2 采精量 公羊一次采精时排出的精液量。 3.3 鲜精 未经处理的新鲜精液。 3.4 精子密度 每单位体积精液中的精子数目。单位为亿每毫升。 3.5 DB63/T 14362015 2 细管冷冻精液 细管注入精液经液氮冷冻所形成的产品。简称“细管精液”或“冻精”。 4 采精前的准备 4.1 冻精制作室的要求 室内清洁卫生，做到无菌操作。 4.2 仪器设备 4.2.1 生产设备 用于藏羊细管冷冻精液生产的仪器设备见表1。 表1 藏羊细管冷冻精液生产设备 4.2.2 检验设备 用于藏羊细管冷冻精液质量检验的设备见表2。 表2 藏羊细管冷冻精液质量检验设备 序号
4、 设备名称 参数 1 相差显微镜 100 倍400 倍 2 恒温恒湿培养箱 0.5 3 净化工作台 菌落数0.5 个每皿每小时 4 数显恒温水浴锅 0.5 5 电热高压灭菌锅 0 Mpa0.25 Mpa 4.3 器械清洗和消毒 器械的清洗与消毒按照NY/T 1234进行。 4.4 稀释液的配制 稀释液的配制按照附录A进行。 5 采精 序号 设备名称 参数 1 精液细管喷码机 2 ACCUCELL 精液密度仪 0.21 毫升0.23 毫升 3 细管封装机 5 250 支0.25 毫升 4 精液程控冷冻仪 45 -140 5 电子天平 0.0 001 克 DB63/T 14362015 3 5.1
5、 采精环境要求 采精场所应保持安静，地面平整，清洁卫生，采精前做彻底消毒。 5.2 藏羊种公羊选用 用于冻精生产的种公羊应符合本品种标准，体质健壮，无遗传缺陷及国家规定的传染病。 5.3 采精频率 12月龄初次调教采精。 成年种公羊每周可采精3天，每天连续采精两次。 5.4 采精方法 5.4.1 台羊选择 选择发情好的健康母羊作台羊，头部固定在采精架上。 5.4.2 假阴道的准备 将消毒过的假阴道内胎，用生理盐水棉球从里到外擦试，在假阴道一端扣上集精瓶，集精瓶夹层内 要注入30 35 的水。在假阴道外壳中部注水孔注入145毫 升150毫升的50 55 水，拧上气 嘴活塞，套上双连球打气，使假阴
6、道的采精口形成丫字形。最后把温度计插入假阴道内测温，温度在38 40 为宜。在假阴道内胎的前1/3，涂抹适量凡士林作润滑剂。 5.4.3 采精操作 采精前，将公羊包皮周围及母台羊后躯擦干净。采精员蹲在台羊右侧后方，右手握假阴道，气卡塞 向下，靠在台羊臀部，假阴道和地面呈35角。当公羊爬跨伸出阴茎时，左手轻托阴茎包皮，迅速地将 阴茎导入假阴道内，当种公羊完成抬头、挺腰、前冲动作时，表示射精完毕。随着公羊从台羊身上滑下 时，将假阴道取下，立即使集精瓶的一端向下坚立，打开气卡塞，放气取下集精瓶，送操作室检查。 6 冻精制作 6.1 准备 生产冻精所用精液应符合本规程7.1的要求。玻璃器皿均应放在 3
7、2 恒温箱中，稀释液放在34 恒温水浴箱中备用。盛装稀释精液的稀释管，应做明显标记。 6.2 精液的稀释与平衡 6.2.1 精液稀释量确定和活力评定 根据鲜精液的密度、活力、采精量等确定应加的稀释液量，确保每剂冻精所含直线前进运动精子数 的要求。精液稀释后和平衡后应评定活力。 6.2.2 稀释方法与平衡 按附录 A 配制稀释液，采用二步稀释法稀释精液。用 34 的第液缓慢地加入精液中，摇匀，所 加第液的量为所加稀释液总量与精液量总和的一半减去精液量，用烧杯盛适量的 34 水，把稀释管 放置于送 4 5 低温柜内降温，与此同时把第液也放入。稀释后的精液，采用逐渐降温法。在 1 小时，使稀释精液的
8、温度降到 4 5 后，然后再在同温的恒温容器内平衡 1 小时 2 小时。冷冻前 DB63/T 14362015 4 半小时加入第液， 所加第液的量为所加稀释液总量减去所加第液的量。 加入第液后平衡半小时， 然后在低温柜中进行细管分装，分装后的细管即可进行冷冻。 6.3 细管的封装与冷冻 6.3.1 细管要求 细管为无毒、耐低温的专用塑料管。 0.25 毫升剂型。保证清洁、无菌。 6.3.2 封装 采用细管（灌装、封口、印字）一体机，在4 低温柜中进行分装操作。 6.3.3 细管标识 细管标识清楚，内容为冻精产地、品种及羊号、冻精生产日期。 6.3.4 细管精液的冷冻 封装好的细管即可通过程控冷
9、冻仪或自制冷冻槽冷冻。 6.3.4.1 程控冷冻仪冷冻 采用程控冷冻仪按预选的最佳冷冻曲线自动完成冷冻过程。冷冻曲线最佳降温速率为：4 -10 （降温速率 5 /min ） ， -10 -100 （降温速率 55 /min） ， -100 -140 （降温速率 20 /min） 。冷冻时间 7分钟。 6.3.4.2 自制冷冻槽冷冻 用自制冷冻槽冷冻细管时，冷冻温度控制-100 -140 。冷冻时间8分钟。 6.4 冻精收集 每冻完一批（只）精液，应立即放入液氮中浸泡，然后计数，取样检查和包装。 6.5 冻精解冻与活力检查 冷冻后的精液可在任一时间进行解冻。解冻时，预先把水浴锅水温加热至38 4
10、0 ，用镊子取 一支冷冻后的细管精液迅速浸泡入水中并晃动，待溶解后立即取出，用吸水纸或纱布擦干水珠，再用细 管剪减去超声波封口端，滴5微升10微升精液于载玻片上进行活力检查。检查方法同6.4。检查合格的 冻精作为初检合格品妥善贮存。 7 精液要求及试验方法 7.1 鲜精质量要求及试验方法 用于藏羊细管冷冻精液生产的鲜精质量应符合表3的要求。有一项不符合的精液，不得用于冻精生 产。 DB63/T 14362015 5 表3 鲜精质量指标 序号 项目 质量指标 试验方法 1 外观 为乳白色或微黄，略有腥味。 自然光下目测。 2 精子活力（%） 65 取精液 5 微升10 微升于载玻片上， 加盖盖玻
11、片 后在38 恒温装置的400倍显微镜上评定活力。 3 精子密度（亿/毫升） 15 用密度仪测定。 7.2 冻精质量要求及试验方法 7.2.1 检验规则 每只公羊每季度冻精型式检验不少于一次。 出站检验的项目：外观、精子活力。检验合格，可作为合格品交付使用。 7.2.2 冻精质量评价 藏羊细管冷冻精液质量应符合表4的要求。 表4 冻精质量指标 序号 项目 质量指标 试验方法 1 细管外观 细管无裂痕、两端封口严实。 目测。 2 剂量（毫升） 0.18 按照 GB 4143 中 B.2 测定。 3 精子活力（%） 35 按照 GB 4143 中 B.3 测定。 4 前进运动精子数（万个） 2 0
12、00 按照 GB 4143 中 B.4 测定。 5 精子畸形率（%） 20 按照 GB 4143 中 B.5 测定。 6 精子顶体完整率（%） 45 按照 GB 4143 中 B.5 测定。 7 细菌数（个） 800 按照 GB 4143 中 B.6 测定。 7.2.3 冻精质量判定要求 每剂冻精解冻后应同时具备上列质量指标要求，不具备任何一项者，为冻精质量不合格。 8 包装、标记和贮存 8.1 包装 用无菌纱布袋包装，一指型管25剂细管，每袋包装量不超过200剂。包装操作应在液氮中进行。 8.2 标记 包装袋外面，均应有明显的标记。注明种公羊品种、公羊号、生产日期或批号、数量、精子活力。 8
13、.3 贮存 用液氮生物容器贮存藏羊冻精，液氮生物容器应符合GB/ T 5458要求。设专人保管，每周定时加一 次液氮，保证冻精始终浸在液氮中。应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器异常，立即将冻精转 DB63/T 14362015 6 移到其他完好的容器内。取存冻精时，冻精离开液氮的时间不得超过5秒。取放冻精之后，应及时盖好 容器塞，防止液氮蒸发或异物浸入。 DB63/T 14362015 7 A A 附 录 A （规范性附录） 稀释液的配制 A.1 试剂要求 配制冻精用的稀释保护剂，应用新鲜的双蒸馏水和卵黄，二级品以上的化学试剂。 A.2 器具要求 所用器具保证清洁、无菌。 A.3 稀释液
14、配方 配方1：双蒸馏水100毫升，蔗糖3.7克，柠檬酸钠3.7克，果糖0.5克，三羟甲基氨基甲烷0.2克，甘 油5毫升，卵黄15%。 配方2：双蒸馏水100毫升，蔗糖3.7克，柠檬酸钠3.7克，果糖0.5克，三羟甲基氨基甲烷0.2克，5 毫升维生素B12，乙二醇5毫升，卵黄15%。 A.4 稀释液的配制 分基础液的配制、第液的配制和第液的配制： a) 基础液的配制：先准确称取蔗糖 3.7 克，柠檬酸钠 3.7 克，果糖 0.5 克，三羟甲基氨基甲烷 0.2 克，放入容器为 100 毫升的量筒内，加蒸馏水 50 毫升左右，用消毒过的玻璃棒搅拌，待 溶解后再加蒸馏水定容至 100 毫升，混匀后用滤纸过滤于三角烧杯中，扎好瓶口，置水浴锅中 隔水煮沸消毒 30 分钟。 b) 第液的配制：取冷却后（室温）基础液的 85 毫升于三角烧瓶中，加入卵黄 15 毫升，用磁 力搅拌器充分搅拌均匀为第液。 c) 第液的配制：取第液 45 毫升 ，加入隔水煮沸消毒好的甘油 5 毫升充分搅拌均匀。 注1： 以上各液每 100 毫升加青、链霉素各（510）万单位。 注2： 稀释保护剂要现配现用。 _
