1、 ICS 65.020.01 B 15 DB52 贵州省地方标准 DB52/T 1501.162020 农作物抗病性鉴定技术规范 第 16 部分:白菜抗芜菁花叶病毒病 Technical specification for evaluation of crop resistance to diseases Part 16： Chinese cabbage resistance to Turnip Mosaic Virus 2020 - 05 - 22 发布 2020 - 09 - 01 实施 贵州省市场监督管理局 发布 DB52/T 1501.16 2020 I 目 次 前 言 . . II
2、1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 鉴定方法 . . 2 5 抗病性评价 . . 3 附录 A（资料性附录） 芜菁花叶病毒病原、症状及发生流行规律 . 4 附录 B（资料性附录） 芜菁花叶病毒病原鉴定及保存方法 . 5 附录 C（资料性附录） 白菜芜菁花叶病毒病抗病性鉴定记载、评价表 . 8 DB52/T 1501.162020 II 前 言 农作物抗病性鉴定技术规范分为17个部分： 第1部分：水稻抗稻瘟病； 第2部分：水稻抗稻曲病； 第3部分：水稻抗纹枯病； 第4部分：小麦抗条锈病； 第5部分：小麦抗白粉病； 第6部分：小麦抗纹枯病； 第7部
3、分：马铃薯抗晚疫病； 第8部分：玉米抗丝黑穗病； 第9部分：玉米抗大斑病； 第10部分：玉米抗小斑病； 第11部分：玉米抗灰斑病； 第12部分：玉米抗南方锈病； 第13部分：辣椒抗枯萎病； 第14部分：辣椒抗炭疽病； 第15部分：白菜抗根肿病； 第16部分：白菜抗芜菁花叶病毒病； 第17部分：大豆抗大豆花叶病毒病。 本部分为农作物抗病性鉴定技术规范的第16部分。 本部分按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 本部分由贵州省植物保护研究所提出。 本部分由贵州省植物保护标准化技术委员会（GZ/TC16）归口。 本部分起草单位：贵州省植物保护研究所
4、长顺县果蔬站 榕江县植保植检站 黔东南州植保植检站 黎平县植保植检站。 本部分主要起草人：王莉爽、刘茜、范刚强、江滋琼、李淳、陈小均、刘学辉、刘荣平、毛世虎。 DB52/T 1501.16 2020 1 农作物抗病性鉴定技术规范 第 16 部分：白菜抗芜菁花叶病毒病 1 范围 本标准规定了白菜抗芜菁花叶病毒病（ Turnip Mosaic Virus， TuMV）鉴定方法与抗病性评价。 本标准适用于贵州区域种植的白菜品种(系) 、种质资源对芜菁花叶病毒抗病性的鉴定和评价。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日
5、期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T 2060.4 辣椒抗病性鉴定技术规程 第4 部分：辣椒抗黄瓜花叶病毒病鉴定技术规程 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本文件。 3.1 芜菁花叶病毒 Turnip Mosaic Virus， TuMV 芜菁花叶病毒是马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus） 的重要成员之一，是一种在全世界广泛存在的植物病 毒，主要危害十字花科植物（病原 、 田间症状和发生规律见附录 A）。 3.2 抗病性 disease resistance 植物体所具有的能够减轻或克服病原物致病作用的可遗传的性状。 3.3 人工接种 artificial
6、 inoculation 在适宜条件下， 通过人为接种的方式将人工培养或收集的病原物置于植物适当部位并使之发病的过 程。 3.4 感病对照 suscepti ble control variety 用于衡量病害发生程度的感病品种。本标准选用当地主栽白菜和美五号为感病对照。 3.5 抗病性评价 evaluation of d isease resistance 根据抗病性分级标准判别白菜对芜菁花叶病毒病的反应程度和抵抗水平。 DB52/T 1501.16 2020 2 4 鉴定方法 4.1 接种体的准备 将准确鉴定的芜菁花叶病毒（ TuMV）储藏于-80 冰箱备用（接种体的鉴定及保存方法见附录B
7、）。 4.2 材料培养 白菜种子直播于营养钵中，每钵直播12 粒种，育苗土为专用育苗基质，设置3 个重复，每个重 复20 株。人工气候室温度设置为白天25 ，夜间20 ；光照设置为每天12 h。定期浇水和防治蚜虫。 4.3 接种 4.3.1 接种时期 苗期鉴定在白菜2叶1心时接种。 4.3.2 接种方法 采用人工摩擦接种法，参考NY/T 2060.4并做修改。接种前，称取一定质量的新鲜病叶放入高温灭 菌过的研钵中，加入5 倍体积的磷酸缓冲液（0.05 mol/L，PH=7.2）研磨匀浆，两层纱布过滤，立即用 于接种。接种时：先在植株的2片真叶的正面洒少许600目金钢砂，然后用手指蘸取病毒汁液在
8、叶面上来 回摩擦24 次，摩擦后用双蒸水立即冲洗叶面；接种后，黑暗24 h再恢复光照。 4.3.3 接种后的植株管理 接种完成后，植株正常管理。 4.4 调查 4.4.1 调查时间 待鉴定材料长至6叶期（一般接种后21 d30 d）进行抗病性调查。 4.4.2 调查和计算方法 共调查2次，接种后21 d调查1次病毒病发病情况， 28 d调查第2 次。用公式1计算病情指数，根据 2次的病情指数结果进行校正，以消除待鉴定材料因生育期不同而导致抗性程度的差异。 100 9 调查总株数 相应级数值）（各级病株数 ）病情指数（ DI . (1) 4.4.3 病情分级 白菜品种抗芜菁花叶病毒病病情分级见表
9、1。 DB52/T 1501.16 2020 3 表1 白菜芜菁花叶病毒病病情分级 病情级别 病情描述 0 植株正常生长，无任何症状。 1 接种叶和心叶初现症状。 3 感病叶片数占全株叶片数1/3以下。 5 感病叶片数占全株叶片数的1/31/2。 7 感病叶片数占全株叶片数1/2以上。 9 多数叶片重花叶，皱缩，畸形或有坏死斑，植株严重矮化，甚至死亡。 5 抗病性评价 根据抗病性鉴定结果对鉴定材料进行抗病性评价，抗性以记载的平均病情级别为准，当感病品种病 情指数达50时，视为该批次鉴定有效。抗病性评价分级见表2。芜菁花叶病毒病抗病性鉴定的田间调查 记录表和抗病性评价表见附录C。 表2 芜菁花叶
10、病毒病抗病性评价分级 抗病性级别 平均病情指数（DI） 抗病性评价 0 DI=0 免疫（I） 1 0.1DI15 抗病（R） 3 15.1DI30 中抗（MR） 5 30.1DI45 中感（MS） 7 45.1DI60 感病（S） 9 DI60.1 高感（HS） A DB52/T 1501.16 2020 4 A B 附 录 A （资料性附录） 芜菁花叶病毒病原、症状及发生流行规律 A.1 病原 TuMV属于马铃薯Y病毒属的病毒，长约650 nm900 nm，直径11 nm15 nm的外壳蛋白包被着的 杆状粒子。杆状类型为弯曲杆螺距3.4 nm3.5 nm（图A.1）。 图A.1 马铃薯 Y
11、病毒属病毒粒子图（756nm13nm） A.2 症状 TuMV侵染白菜后初期表现黄化、花叶、深绿浅绿相间以及沿叶脉褪绿等症状，后期出现畸形、矮 化、整株畸形、生育期推迟甚至死亡等（图A.2）。 图 A.2 TuMV 危害白菜田间症状图 A.3 发生流行规律 TuMV主要通过蚜虫以非持久性的方式传播，也通过种子和受感染的活植物材料传播。 DB52/T 1501.16 2020 5 B C 附 录 B （资料性附录） 芜菁花叶病毒病原鉴定及保存方法 B.1 TuMV的分子鉴定 B.1.1 植物总RNA的提取 选取病毒病症状明显的样品， 使用植物总RNA小提试剂盒进行植物总RNA提取。 实验过程要勤
12、换手套， 戴好口罩，使用RNase-free的枪头，离心管、试剂和水: a) 取 1 ml 裂解液，转入 1.5 ml 离心管中，备用； b) 液氮中研磨适量白菜叶片成细粉后，取 60 mg100mg 细粉转入上述装有裂解液的离心管, 立 即用手剧烈振荡 20 s 充分裂解； c) 将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育 5 min 以使核蛋白体完全分解； d) 每 1ml 裂解液加 0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡 15 s 并将其在室温下孵育 3 min； e) 于 4 12,000 rpm 离心10 min，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相， RNA 存在于水相中
13、。水相层的容量大约为所加裂解液体积的 50%，把水相转移到新管中，进行 下一步操作； f) 加入水相 0.5 倍体积的无水乙醇，混匀，转入吸附柱 RA 中； g) 12,000 rpm 离心 1 min，弃废液，将吸附柱重新套回收集管； h) 加 500 L 去蛋白液，12,000 rpm 离心 1 min，弃掉废液； i) 加入 500 L 漂洗液（检查加入无水乙醇），12,000 rpm 离心 1 min，弃掉废液； j) 重复步骤 9一次； k) 将吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇 抑制下游反应； l) 取出吸附柱，放入
14、一个 RNase free 离心管中，加 50 L80 L RNase free water，室温 放置2 min，12,000 rpm 离心 1 min。如果需要较多 RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附 柱中，离心 1 min； m) 弃去柱子，把 RNA 保存于-80 。 B.1.2 cDNA的合成 以感染芜菁花叶病毒叶片的总RNA为模板，使用 GoScripTM Reverse Transcription System试剂盒，合 成互补的脱氧核糖核酸，操作步骤严格按照说明书进行： a) 在 RNase-free 离心管中按照如下表格所列的组分，配置好反应所需要的体系，并混匀； 表 B
15、.1 cDNA 反转录试剂预混体系 组分 使用量 Random Primer 1L 模板RNA 4L 总体积 5L DB52/T 1501.16 2020 6 b) 70 孵育5 min，立即置于冰上冷却至少 5 min（为了使 RNA模板充分变性，提高反转录的效 率）。按照如下表格所示的体系向离心管中继续加入反应所需的其它试剂 20 L，轻轻混匀。 表 B.2 cDNA 反转录试剂体系 组分 使用量 上述变性后反应液 5L GoScripTM5Reaction Buffer 4L MgCl2 3L PCR Nucleotide Mix 1L GoScripTM Reverse Transcr
16、iptase 1L RNase free ddH2O 6L 总体积 20L 注： 反转录的反应参数设置如下：25 5 min，42 60 min，70 失活15 min，之后立即放在-20 保存备 用。 B.1.3 RT-PCR的扩增 B.1.3.1 以cDNA为模板，进行常规PCR扩增反应，总体系为25 L。根据基因号(NC_0025 09) TuMV全 长设计特异性引物为： a) TuMV-F：5 -TAAACGGAATGTGGGTGATGATGG-3； b) TuMV-R：5 -GTCCTCGGTCGTATGCCTTTCC-3。 B.1.3.2 按照表B.3所示的比例， 向经灭菌处理的P
17、CR管内添加PCR反应的各成分； 反应体系瞬时离心后， 去除管内气泡，充分混匀，再按照表B.4所示的参数，设置PCR的反应参数；使用1%浓度的凝胶对扩增产 物进行核酸电泳的检测。 表 B.3 PCR 的反应体系 组分 使用量 10Buffer 2.0 L dNTPs， （10 mmoL/L） 1.6 L 上游引物F， （10 moL/L） 0.5 L 下游引物R， （10 moL/L） 0.5 L DNA模板 1.0 L TOPTaq DNA聚合酶， （5 /L） 0.3 L 加灭菌ddH2O 至 20 L 表 B.4 PCR 的反应条件 反应阶段 时间 94（预变性） 3 min 94（变性
18、） 30 s 55（退火） 30 s 72(延伸) 30 s 步骤24循环 34 cycles 72(彻底延伸) 10 min 4 DB52/T 1501.16 2020 7 B.1.4 PCR扩增产物的凝胶电泳检测 B.1.4.1 统计好需检测样品的个数，选择合适的梳子和板子。 B.1.4.2 准备1个量程为250 mL的三角瓶，称取0.25 g琼脂糖（Agarose）至三角瓶，再向三角瓶中加 入25 mL的1 TAE电泳缓冲液。 B.1.4.3 混匀后将三角瓶置于微波炉中高火加热，等瓶内固体完全熔解后，再放置桌面冷却。 B.1.4.4 将三角瓶内的液体全部倒入已插好梳子的板子中。 B.1.
19、4.5 等30 min后琼脂糖将会完全冷却并凝固，再小心拔下梳子，准备进行核酸电泳。 B.1.4.6 清洗干净核酸电泳槽之后，往电泳槽内倒入适量的1 TAE电泳缓冲液，当缓冲液淹没过凝胶 孔即可。 B.1.4.7 取4 LPCR产物、2 L1:10000的SYBR Green I荧光染料和1 L上样缓冲液 6 Loading buffer 充分混合，用移液器全部点入凝胶孔中；Marker的配比为：2 L 1:5000的SYBR Green I染料和5 L T rans2KTMPlusII DNA Marker。 B.1.4.8 打开电泳仪的电源，设置电压120 V，电流为400 mAH。 B.
20、1.4.9 利用凝胶成像系统观察电泳结果并拍照记录。 B.1.4.10 目的片段测序验证 目的片段大小与预期一致的产物送至测序公司完成核酸序列的测定工作。 最后确定分子检测的结果 是否为芜菁花叶病毒（ TuMV）。 B.2 病原物鉴定及保存 B.2.1 病毒的采集、纯化和保存 将黄化或花叶的白菜病毒病样品进行 RNA提取， cDNA合成，用芜菁花叶病毒（ TuMV）的特异性 引物进行 RT-PCR扩增，产物测序鉴定为 TuMV。 然后采用枯斑分离法，将 TuMV测序正确的样品加入接 种缓冲液，摩擦接种到枯斑三生烟（或心叶烟），7 d 10 d待烟叶上长出枯斑，挑取单个枯斑再次接 种到烟叶，重复
21、 2 次。纯化后 TuMV接种到易感病白菜活体保存或将纯化后芜菁花叶病毒的样品储藏于 -80 冰箱备用。 B.2.2 病原物繁殖 将纯化的TuMV毒源接种到感病品种的白菜（如和美五号，经室内和田间鉴定为感病），显症后用 RT-PCR进行验证，确定为TuMV株系。取感病白菜0.5 g1 g，加入1 ml接种缓冲液接种56片叶的白菜 上进行大量扩繁，为抗性鉴定准备充足的毒源。 DB52/T 1501.16 2020 8 C D 附 录 C （资料性附录） 白菜芜菁花叶病毒病抗病性鉴定记载、评价表 表 C.1 白菜芜菁花叶病毒病抗病性鉴定田间调查记载表 播种（移栽）日期： 鉴定地点： 经纬度： 海拔： 接种日期 ： 调查人： 记录人： 调查日期： 病情分级 鉴定 编号 重复 总株数 0 1 3 5 7 9 I III I III I III 表 C.2 白菜芜菁花叶病毒病抗病性评价表 鉴定 编号 鉴定 品种 重复I 病情指数 重复II 病情指数 重复III 病情指数 平均 病情指数 抗病性 级别 抗病性 评价 g3 _ DB52/T 1501.1 6 -2020
