1、 1 ICS 65.150 B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24662018 鲇拟态弧菌病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 24662018 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语与定义 . . 1 4 试剂和材料 . . 1 5 设备和器械 . . 2 6 临床检查 . . 2 7 实验室样品采集 . . 2 8 细菌分离与纯化 . . 2 9 细菌鉴定 . . 2 10 结果判定 . . 4 11 综合判定 . . 5 附
2、录 A（规范 性附录） 试剂配方 . 6 附录 B（资料性附录） 拟态弧菌 dnaJ 基因 DNA 参考序列（177 bp） . 8 DB51/T 24662018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、陈德芳、韩帅、黄小丽、欧阳萍、牟维豪、赵偌璇。 DB51/T 24662018 1 鲇拟态弧菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了南方鲇拟态弧菌病诊断的术语与定义、试剂和材料、设备和器
3、械、临床检查、实验室 样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于南方鲇（ Silurus meridionalis）、黄颡鱼（ Pelteobagrus fulvidraco）与杂交鲇（ Silurus soldatovi meridionalis）拟态弧菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.7 食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染
4、色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 术语与定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 鲇拟态弧菌病 指由拟态弧菌 （ Vibrio mimicus） 感染引起南方鲇、黄颡鱼与杂交鲇等鲇鱼发病或死亡的一种细菌 性疾病。 3.2 dnaJ 基因 热休克蛋白40管家基因。 3.3 TSA Tryptic Soy Agar 胰蛋白胨大豆琼脂培养基。 4
5、试剂和材料 DB51/T 24662018 2 4.1 试剂、染色液与培养基 按GB/T 4789.28、GB/T 18652、SC/T 7014与GB/T 4789.7规定执行，Taq酶、dNTPs、1 0PCR缓冲 液（无Mg 2+ ）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述 未提及的见附录A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.3 引物 dnaJ基因 DNA序列扩增引物， P-F：5 -CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA-3，P-R：5 -YCTTGAAGAAGCGGTT CGTGCA-3，20保存。 5 设备
6、和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳丝、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌 锅、恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR 管、水平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼反应迟钝，离群独游，摄食减少或停止摄食。 6.2 外部检查 病鱼头部、背部与腹侧体表出现方形或不规则形褪色斑，并逐渐发展到皮肤坏死，形成溃疡，臀鳍 与尾鳍基部出血。 6.3 剖检 肝肿大，斑点状出血；脾、肾肿大，呈暗红色；部分病鱼腹腔内可见少量淡黄色腹水。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 执行
7、。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，从鱼的肝、肾及体表病灶组织中直接分离接种，或将样品置于无菌离心管中，用 无菌盐水冲洗并捣碎，然后分离接种。样品常规划线接种 TSA琼脂培养基（A.1），28培养24h-48h。 从中挑选取优势菌落划线接种在TSA平板进行纯化培养。 9 细菌鉴定 DB51/T 24662018 3 9.1 革兰氏染色 按 GB/T 4789 .28 中2.2的规定执行。 9.2 生理生化试验 9.2.1 过氧化氢酶（接触酶）试验 按 SC/T 7014 表2的接触酶试验的规定执行。有气泡产生为阳性；不产生气泡为阴性。 9.2.2 酯酶（Tween 80）试验 将待检菌接种
8、于酯酶（Tween 80）测定培养基平板（A .2），28培养7d在细菌生长的周围有模糊 晕圈者为阳性；无模糊晕圈者为阴性。 9.2.3 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性； 不变色为阴性。 9.2.4 硫化氢试验 按 GB/T 4789.2 8 中3.14的规定执行。培养基呈黑色为阳性、不呈黑色为阴性。 9.2.5 丙二酸盐试验 按 GB/T 4789 .28 中3.7的规定执行。培养基由绿色变为蓝色为阳性；不变蓝色为阴性。 9.2.6 柠檬酸盐试验 按 GB/T 4789 .28 中3.7的规定执行。培养基由绿色变为蓝色为阳性；不
9、变蓝色为阴性。 9.2.7 硝酸盐还原试验 按 SC/T 7014 表2的硝酸盐还原试验的规定执行。若呈红色为阳性；不呈红色为阴性。 9.2.8 吲哚试验 按SC/T 7014表2的吲哚试验的规定执行。培养基变红色为阳性；不变红色为阴性。 9.2.9 糖、醇类（D-葡萄糖、D-甘露醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A .3），28培养24h后观察。培养基变黄色为阳性， 不变黄色为阴性。 9.3 dnaJ 基因 PCR 扩增与同源性分析 9.3.1 DNA 提取 取2mL待检菌培养液， 12000r/min离心1min， 收集菌体。 菌体悬浮于500 L TE缓冲液 （pH
10、8.0） （A .4） ， 震荡悬浮，加入50 L 10的SDS溶液（A .5），10 L 20mg/mL的蛋白酶K（A .6），混匀，37温育1h。 加入100 L 5mol/L的NaCl溶液（A .7），充分混匀，再加入100 L CTAB/NaCl溶液（A.8）混匀，65温 育20min。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（A .9），混匀，12000r/min离心5min。取上清 液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A .10），混匀，12000r/min离心5min。取上清液，加入1倍体 DB51/T 24662018 4 积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，1
11、0000r/min 离心10min；沉淀用70酒精洗涤2次，室温晾干。 加入50 L的TE缓冲液溶解，-20贮存，备用。 9.3.2 dnaJ 基因 PCR 扩增 PCR反应体系： 10 PCR缓冲液（无Mg 2+ ）5.0 L，MgCl 2（25mmol/L）5.0 L，dNTP s（10mmol/L）1.0 L， 引物(20 mol/L)P-F和P-R各1.0 L，Taq DNA酶（5U/ L）0.5 L，DNA模板1.0 L，无菌双蒸水补足致50 L。 混匀后，3000r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。 PCR反应条件：94预变性3min；94变性
12、30s；60 退火30s；72延伸1min；35次循环；72延 伸7min；4保温。 9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A .11）配制1的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没 胶面。将上述6 L样品和2 L溴酚蓝指示剂溶液（A .12）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物 作对照。120V电泳约20-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察，并在长波紫外灯下用刀片 切下含目的条带（约约177bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。 9.3.4 PCR 扩增产物纯化、测序及同源性分析 9.3.4.1 PCR 扩增产物纯化 9.3.4.1.1 在长波
13、紫外灯下用刀片切下含目的条带（约 177bp）的胶块，放入无菌离心管中称重； 9.3.4.1.2 按每 0.1g 琼脂糖凝胶加 0.1mL 酚，将酚加入 9.3.3 含有目的条带胶块的离心管中。 9.3.4.1.3 经漩涡震荡仪震荡 1min-2min，将离心管在-70放置 1h，使凝胶完全冻结。 9.3.4.1.4 37水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡 1min-2min；14 000r/min 离心 5min。 9.3.4.1.5 取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25241）（A.9）， 混匀，12000r/min 离心 5min。 9.3.4.1.6
14、 取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A.10），混匀，1 2000r/min 离心 5min。 9.3.4.1.7 向收集的水溶液中加入 1/10 体积的 3mol/L 的乙酸钠和 2 倍体积的无水乙醇， 置-20过夜 或-70放置 1h-2h。 9.3.4.1.8 14000r/min 离心 10min，弃上清。 9.3.4.1.9 将沉淀的 DNA 溶于适当体积的 TE 缓冲液（A.4）中，置-20保存，待测。 9.3.4.2 PCR 扩增产物测序与同源性分析 将9.3.4.1纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列（附录B）进行比对分析。 10 结果判定 10.1 菌落
15、形态 28培养24h-48h，形成圆形、隆起、光滑、边缘整齐呈半透明状的菌落。 10.2 细菌染色 革兰氏染色为阴性弧形、豆点状或短杆菌。 10.3 生理生化试验 DB51/T 24662018 5 生理生化反应试验结果见表1。 表1 拟态弧菌的生理生化反应结果 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 过氧化氢酶 + 柠檬酸盐 + 乳糖 + 酯酶 - 硝酸盐还原 + D-甘露醇 + 氧化酶 + 丙二酸盐 - D-葡萄糖 + 硫化氢 - 蔗糖 - 吲哚 + 注： “+”为阳性， “-”为阴性。 10.4 dnaJ 基因 PCR 扩增与序列的同源性分析 PCR扩增获得约177bp的 dna
16、J基因目的片段，其序列与附录所列的基因序列进行比对，同源性达99% 以上。 11 综合判定 符合以下所有特征者判定为鲇拟态弧菌病： a) 临床症状与 6 相符； b) 菌落形态和染色观察与 10.1 和 10.2 相符； c) 生理生化反应结果与 10.3 相符； d) dnaJ 基因 PCR 扩增及序列同源性分析结果与 10.4 相符。 DB51/T 24662018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配方 A.1 TSA琼脂培养基 胰蛋白胨 17.0g 大豆蛋白胨 3.0g 氯化钠 5.0g 葡萄糖 2.5g 磷酸氢二钾 2.5g 琼脂粉 2%-3% 加热搅拌溶解于1000ml蒸
17、馏水中，121灭菌30min，冷却至60倒铺培养皿。 A.2 酯酶（Tween80）试验测定培养基 基础培养基： 蛋白胨 10g NaCl 5g CaCl7H2O 0.1g 琼脂 9g 蒸馏水 1000mL 调pH至7.4，于120灭菌20min 底物：Tween80，于120灭菌20min 冷却基础培养基至40-50，加Tween80至终浓度为1，倒平板。 A.3 糖、醇类发酵培养基 蛋白胨 2g NaCl 5g K2HPO4 0.2g 被测糖或醇类 10g 琼脂 6g 溴百里酚蓝1水溶液 3mL （溴百里酚蓝先用少量95乙醇溶解后，再加水配制1的水溶液） 蒸馏水 1000mL pH7.0-
18、7.2，分装试管，培养基高度约4.5cm，115灭菌20min。 A.4 TE缓冲液（pH8.0） DB51/T 24662018 7 将0.121g Tris碱（分子量121.1），0.0 372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水 中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.5 10SDS溶液 将10g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中， 加热至68助溶， 再加入双蒸水定容至100mL， 室温保存。 A.6 蛋白酶K（20mg/mL） 将蛋白酶K溶解于双蒸水中，至终浓度20mg/mL，分装入小管，置-20保存。 A.7 5mol/L的NaC
19、l溶液 将29.22g NaCl（分子量58.44 ）溶解于80mL双蒸水中，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.8 CTAB/NaCl溶液 4.1g NaCl溶解于80mL双蒸水中，缓慢加入1 0g CTAB，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.9 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） 将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE 缓冲液，4保存。 A.10 氯仿：异戊醇（24:1） 将24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中。 A.11 50TAE电泳缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加
20、入28.55mL冰乙酸和50ml 0.5/L EDTA。再加双蒸水定容至 500mL，室温保存。使用时，配成1 TAE电泳缓冲液。 A.12 溴酚蓝指示剂溶液 6 上样缓冲液 将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。 待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴 酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。 DB51/T 24662018 8 B B 附 录 B （资料性附录） 拟态弧菌 dnaJ 基因 DNA 参考序列（177bp） 1 ATGGAACTGA GCCTTGAAGA AGCGGTTCGT GGATGTTCGA AAGAAATTGA AGTCCCAACT 61 TTGGTTCACT GCGATGCTTG TGATGGTTCT GGTGCGAAAA AAGGCACTTC AGCACAAACT 121 TGTGGAACCT GTCATGGTCA TGGACAAGTC CAGATGCGTC AGGGCTTCTT TGCGGTG _ DB51/T 24662018
