1、ICS 65.020.40 B 61 DB51 四川省地方标准 DB51/T 25822019 应用微卫星 DNA 标记扭角羚个体司法鉴定 技术规范 2019 - 04 - 16 发布 2019 - 05 - 01 实施 四川省市场监督管理局 发布 DB51/T 25822019 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引 用文件 . . 1 3 术语、定 义和缩略语 . . 1 4 PCR 引物的选择 . 1 5 DNA 的提取与检测 . 1 6 PCR 反应与 PCR 产物测序 . 2 7 基因分型 . . 2 8 个体识别 . . 3 附录 A（规范性附录） 扭角
2、羚微卫星标记信息 . 4 DB51/T 25822019 II 前 言 本标准按GB/T1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则的规定编写。 本标准由四川省林业和草原局提出并归口。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准主要起草单位：四川省林业科学研究院。 本标准主要起草人：靳伟 毛毳 刘滢询 费然 夏云。 DB51/T 25822019 1 应用微卫星 DNA 标记扭角羚个体司法鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了利用DNA 简单重复序列微卫星分子标记对扭角羚进行司法鉴定的原理、试剂、仪器、 分析步骤和结果判定标准。 本标准适用于四川省扭角羚个体司法鉴定。 2 规范性
3、引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范 SN/T 1193-2003 基因检验实验室技术要求 NY/T 1673-2008 畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 3 术语、定义和缩略语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA 样品 DNA sample 是指利用扭角羚组织（如毛发、血液、精液、肌肉组织等）或新鲜粪便提取的扭角羚基因组DNA。 3.2 微卫星特异性引物 Microsate llite
4、specific primers 用于扭角羚微卫星DNA分子鉴定选用的一套微卫星引物。具有多态性、稳定性、重复性等综合特点。 统一推荐使用9个微卫星标记（附录A），其中1-7号为基本标记，8-9号为备选标记，可根据工作目标选 用合适数量的微卫星标记。只有当基本标记不够用时，才使用备选标记。 4 PCR 引物的选择 推荐使用的9个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录A。 5 DNA 的提取与检测 DB51/T 25822019 2 5.1 DNA 样品准备 通过现场或实验室取样，将DNA样品用蒸馏水洗净后放入盛有95酒精的离心管中，4保存待用。 5.2 基因组 DNA 的提取 采用酚氯仿抽提方
5、法提取总DNA，具体操作参照分子克隆实验指南（第3版）。 其他DNA提取方法若DNA质量能够符合PCR扩增需要的都可用于本标准。 5.3 DNA 浓度检测 5.3.1 紫外吸收定性测试 应保证 A260 A280比值在 1.82.0范围内，方可正常进行后续实验。 5.3.2 紫外吸收定量测试 应保证 DNA浓度在 10 g/mL以上，方可正常进行后续实验。 6 PCR 反应与 PCR 产物测序 6.1 PCR 扩增的反应体系和扩增程序 10PCR buffer 2.0 L MgCl2 (25mmol/L) 2.0 L dNTP (2.5mM) 1.0 L Taq polymerase (2.5
6、U/L) 0.2L 引物-F（15 pmol/ L） 0.5 L 引物-R（15pmol/ L） 0.5 L 模板DNA 2.0 L ddH2O 11.0 L BSA (1mg/mL) 0.8 L 合计 20 L PCR扩增程序：95预变性5分钟，然后35个循环包括94变性 50 s, 55-65（根据不同的引物 确定）退火45s, 72 延伸30s ，最后72 延伸10分钟，4保存。 6.2 PCR 产物的质量检测 当PCR扩增完成后，取PCR产物5L，经1.5 %-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小 正确，表明PCR扩增成功； 将符合质量要求的PCR产物避光（使用锡箔纸盒）存放于4冰箱，用于基因分型； 7 基因分型 将符合质量要求的PCR产物送有关公司进行基因扫描分型。 为了获得更加可信的基因型，最好宜采用多管PCR（multi-tube approach）扩增方案。
