1、 1 ICS 65.150 B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24582018 大鲵蛙病毒病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 24582018 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 试剂和材料 . . 1 5 设备和器械 . . 2 6 临床检查 . . 2 7 实验室样品采集 . . 2 8 病毒分离 . . 2 9 病毒鉴定 . . 3 10 综合判定 . . 4 附录 A（规范性附录） 试 剂 配
2、方. . 5 附录 B（资料性附录） 大鲵蛙病毒 MCP 基因参考序列（531 bp） . 6 DB51/T 24582018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.12009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、刘丹、余泽辉、陈德芳、黄小丽、欧阳萍、邓梦玲。 DB51/T 24582018 1 大鲵蛙病毒病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了大鲵蛙病毒病诊断的术语与定义、试剂和材料、临床检查、实验室样品采集、病毒分 离、病毒鉴定和综合
3、判定等技术规程。 本标准适用于大鲵蛙病毒病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 大鲵蛙病毒病 指由大鲵蛙病毒(Chinese giant salamand er ranavirus
4、， CGSRV)感染引起的大鲵发病或死亡的一 种病毒性疾病。 3.2 CPE Cytopathic effect 细胞病变效应。 3.3 EPC Epithelioma papulosum cyprini 鲤鱼上皮瘤细胞。 3.4 MCP Major capsid protein 基因 主要外膜蛋白基因。 4 试剂和材料 DB51/T 24582018 2 4.1 水 用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。 4.2 试剂与培养基 按 GB/T 4789.28 与 SC/T 701 4 规定执行。鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）、小牛血清（FBS）、M199营 养液、青霉素、链霉素、Mix-rea
5、ction buffer、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试 剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。 4.3 引物 MCP基因序列PCR扩增引物： P1-F： 5 -GACTTGGCCACTTAGA-3，P1-R：5 -GTCTCTGGAGAA GAGAA-3。 - 20保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子和手术刀、组织匀浆器、电子天平、高压灭菌锅、超净工作台、普通冰箱、超 低温冰箱、一次性滤器（0.22m）、倒置显微镜、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、水平电 泳系统、凝胶成像系统与CO 2培养箱等。 6 临床检查 6.1 临床症状
6、 病鲵食欲减退，摄食减少，甚至停止摄食，部分病鲵出现呕吐，偶尔呕吐物混有血液；体表粘液分 泌增多，活动缓慢，反应迟钝，常静卧池底。 6.2 外部检查 病鲵全身性肿胀、出血，尤其头部与四肢明显，体表皮肤与肌肉溃烂，形成溃疡，严重时肿胀的四 肢溃烂。 6.3 剖检 口腔黏膜偶见出血与溃疡；腹腔常见淡黄色澄清或含血液体；肝肿大，淤血、出血，呈花斑状；脾 肿大，严重瘀血呈紫黑色或散在灰白色坏死灶；肾肿大，斑点状出血；肺囊充血、出血；胃肠道呈出血 性卡他性炎。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 与 GB/T180 88 执行。体长5cm的大鲵苗取整条，体长5-10cm的大鲵苗取 内脏（
7、包括肾），体长10cm的大鲵则取肝、脾、肾。 8 病毒分离 8.1 样品处理 DB51/T 24582018 3 应在10以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆，再用细胞培养液PBS缓冲液(A.1)按1:10的最终稀 释度组织悬液，加入100IU/ml双抗（青霉素、链霉素A.2）后，置4冰箱作用1-2h后，反复冻融3次， 用0.22 m的一次性滤器过滤除菌，滤液保存于20或以下温度冷冻保存。 8.2 细胞接种与观察 将上述滤液用细胞培养液(A.3)再做两次10倍稀释，然后将这1:10、1:100、1:1000三种稀释度的滤 液，分别接种到生长24-48h的EPC单层细胞，按每2cm2的细胞单层接种
8、100 L， 的中，25 C吸附1-2h后弃 病毒液，然后加含2% FBS和100IU/ml双抗的M199细胞培养维持营养液(A.4)，置于25 C培养。接种滤液 后的细胞，7d内每天用倒置显微镜观察CPE出现情况。典型的CPE为细胞空泡、变圆、脱落。若细胞出现 CPE，收集细胞液进行鉴定。若细胞在接毒后7d未出现 CPE，盲传一次，再培养观察7d，未出现CPE的样 品则判定为阴性。 9 病毒鉴定 9.1 样品处理 对有临床症状的大鲵，按8.1的要求取样匀浆后取50mg-100mg于1.5ml EP管中；对出现CPE的细胞培 养样品取450 L于1.5ml EP管中。用CGSRV 核酸作为阳性
9、对照，无感染CGSRV大鲵正常组织或无病毒感染 的细胞培养物为阴性对照，用等体积的双蒸水作为空白对照。 9.2 DNA 提取 DNA提取可使用商品化的组织病毒DNA抽提试剂盒(按说明书操作)，或使用传统酚-氯仿提取法，具 体操作如下（传统法）： a) 将样品置于-40冰箱反复冻融 3 次，12000r5min； b) 取上清 400 l，加入 500 l tris-饱和酚，充分混合，静置 5min，12000r5min，4 ； c) 取上清加入饱和酚，氯仿各 200 l，混匀，静置 5min，12000r5min，4。重复一次； d) 取上清加入 200 l 氯仿，混匀，12000r5min，
10、4，此时将出现分层。如果中层蛋白多，则 重复上一步骤； e) 取上清加 1-2 倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置 20min，12000r5min，4； f) 弃上清，用 75%酒精洗涤，12000r 5min，4，重复操作一次； g) 弃上清，操作台中自然晾干后，20-30 lTE 溶解沉淀，-20保存，备用。 9.3 PCR 扩增反应 在PCR管中加入12.5 l Mix-reaction buffer，上下游引物各 1 l（10umol/L），DNA模板 1 l， 加入 9.5 l 无菌双蒸水至 25 l 体积。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。混匀 后，3000r/
11、min离心30s。 将PCR管置于PCR仪， 按下列程序进行PCR 扩增： 94预变性 4mim， 94变性 1min， 55退火 1min， 循环30 次，最后 72延伸 1min，最 后在 72延伸 10min，4保存。 9.4 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A . 5）配制1的琼脂糖（A . 6）平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液 （A .7）刚好淹没胶面。将上述6 L样品和2 L溴酚蓝指示剂溶液（A .8）混合后加入样品孔，使用DNA 分子量标准参照物作对照。120V电泳约20-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察。 DB51/T 24582018 4 9.5
12、 结果判定 阳性对照出现约500bp的DNA片段，阴性对照和空 白对照没有该扩增条带。待测样品出现约500bp的 扩增带，则判定为阳性如果扩增的DNA条带大小与阳性片段接近难以确定，则需要对PCR扩增产物进行纯 化与测序，若对PCR扩增产物纯化、测序，并与 已知序列（附录B）比对，同源性达98%以上则为阳性， 否则为阴性。 10 综合判定 有临床症状，满足以下任何一条都可以确诊为CGSRV阳性，判定患大鲵蛙病毒病。 a) 细胞培养出现典型 CPE，PCR 检测阳性； b) 直接提取病灶组织 DNA 作为模板，PCR 检测阳性； c) 若没有临床症状，满足以下任何一条都可以确诊为 CGSRV 阳
13、性，判定为 CGSRV 携带； d) 细胞培养出现典型 CPE，PCR 检测阳性； e) 直接提取组织 DNA 作为模板，PCR 检测阳性。 DB51/T 24582018 5 A A 附 录 A （规范性附录） 试 剂 配 方 A.1 PBS (0.01 mol/L, pH 7.4) 800 mL超纯水中溶解 8gNaCl，0.2g KCl，3.58g Na 2HPO412H2O，0.24g KH2P04，用1mol/L HCl调 节pH为7.4，加超纯水定容至1L，高压灭菌，室温保存备用。 A.2 双抗 将青霉素和链霉素霉素用超纯水配成各为10,000IU/mL浓度的混合储存液，经0.22
14、 m孔径的滤膜过 滤后分装，-20 C保存，使用时的工作浓度为100 IU/mL。 A.3 M199 营养液 按说明书方法进行配制，按说明书加入一定量的NaHCO 3调节营养液 pH值为7.2，定容至1L，0.22 m 滤器过滤除菌后分装，4 C保存备用。 A.4 细胞生长液（含 10%胎牛血清的M199） 、细胞维持液（含 2%胎牛血清的M199）相应加入胎牛血清即 可。 A.5 TE缓冲液（pH8.0） 将0.121g Tris碱（分子量121.1），0.0 372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水 中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。
15、 A.6 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖1g中加入1xTAE缓冲液100mL，加热溶解后，加入5 L Goldenview混匀。 A.7 50TAE电泳缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加入28.55mL冰乙酸和50mL 0.5/L EDTA。再加双蒸水定容至 500mL，室温保存。使用时，配成1 TAE电泳缓冲液。 A.8 溴酚蓝指示剂溶液 6 上样缓冲液 将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。 待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴 酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。 DB51/T 24582018 6 B B 附 录 B （
16、资料性附录） 大鲵蛙病毒 MCP 基因参考序列（531bp） 1 GTCTCTGGAG AAGAAGAATG GGAGGGGAAG AACCAGGTTC TTGGCCGGGA GGACCCTGGC 61 TCCGTTCTGG CCTGTGGCCG GGGCGGGGTT GATGAGATCG CTGGTGTTGC CTATCATGTT 121 ATAGTAGCCT ATGCGCTTGG CCTCTGGCAT GGTGTACTCG CTCCAGGCGT CCAGGTATGC 181 CGTGTTAAAG GACTGGGCGC TGATGTCGTT GAATGAGAGG TTGACGTTCT CCA
17、CAATGTT 241 GTGCATGGGG TTCTTTGTCC ACCTGATGGT GCCGTTGTCT CCCAGCTGGT TTGCGGCCAG 301 GAGCTTGACC TCGGGGGTCT TGAGCACCAA CCAGGCGTTG AGGATGTAAT CCCCCGACCT 361 GGGAACGCCG ACCGAAAACT GCTGCCCGAA AGCCGGGTTA CCCGACATCT TGGCAGCCAG 421 AGACGGCAGC TTGGTGAACC ACCCCACGGG GTAGTGCTCC TTGACAAAGT ACGTGGTGGC 481 ATCCGAACCC CCGTACATTG CTCTCTCAAG ATTGTCATAA GTGGCCAAGT C _ DB51/T 24582018
