1、 1 ICS 65.150 B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24572018 斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 2018 - 05 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 24572018 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 试剂和材料 . . 1 5 主要设备和器械 . . 2 6 临床检查 . . 2 7 样品采集 . . 2 8 细菌分离与纯化 . . 2 9 细菌鉴定 . . 2 10 结果判定 . . 4 11 综合判定 . . 5
2、附录 A（规范 性附录） 试剂配方 . 6 附录 B（资料性附录） 柱状黄杆菌 16S rR NA 基因参考性序列（147 7bp） . 8 DB51/T 24572018 II 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：黄小丽、耿毅、陈德芳、欧阳萍、段靖、冯杨。 DB51/T 24572018 1 斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了由柱状黄杆菌 （ Flavobacterium co
3、lumnare） 引起的斑点叉尾鮰 （ Ietalurus Punetaus） 柱形病的临床症状、病原鉴定方法与结果判定。 本标准适用于由柱状黄杆菌感染导致的斑点叉尾鮰柱形病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验方法 GB/T 28630.4 白斑综合征（WSD）诊断规程 第4部分
4、：组织病理学诊断法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.2 鱼类细菌病检疫技术规程 第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法 SC/T 7213 鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 斑点叉尾鮰柱形病 指由柱状黄杆菌（ Flavobacterium columnare）感染引起斑点叉尾鮰（ Ietalurus Punetaus）发病 或死亡的一种细菌性疾病。 4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液与培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照GB/T 4789.28、 GB
5、/T 18652、SC/T 7014规定执行， Taq酶、dNTPs、10 PCR缓冲液（无Mg 2+ ）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司 提供的商品化试剂；微生物生化鉴定管可代替相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附录A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 DB51/T 24572018 2 4.3 引物 16SrRNA基因DNA序列扩增引物，P-F：5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， P-R：5 -GGTTACCTTGTT ACGACTT-3，保存引物的使用浓度为20 mol/L，-20保存。 5 主要设备和器械 超净工
6、作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、高速冷冻离心机、水平电泳系统、凝胶成像系统、普通光 学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移液器、普通冰箱 、解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、 铂耳丝、酒精灯等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼体色发黑，反应迟钝，靠边、游动迟缓，摄食减少或停止摄食。 6.2 体表检查 病鱼可出现不同程度烂尾、烂鳍、烂鳃、皮肤灶性腐烂或体表溃疡灶，部分可在唇部、头部等身体 多个部位出现黄色增生物。 6.3 剖检 病鱼内脏器官病变表现常不明显，偶见脾脏肿大发黑。 7 样品采集 样品采集按SC/T 7103 执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，从病鱼溃疡灶边缘、烂鳍烂
7、尾处直接分离接种，常规划线接种至Shieh培养基。 或将病变鳍条或鳃丝剪下，直接放置在Shieh培养基上接种。28培养24h-48h，从中挑取黄色、边缘不 整齐、假根状、中央较厚的单个菌落在Shieh培养基上进行纯化培养。Shieh平板的配制方法见附录A.2。 9 细菌鉴定 9.1 革兰氏染色 按GB/T 4789.28中2.2的规定执行。菌体细长、弯曲或直的杆状，革兰氏染色阴性, 菌体大小约(4 8)m(0.50.7)m。 9.2 生理生化试验 9.2.1 葡萄糖利用试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.13的规定执行，培养基变黄色为阳性。 DB51/T 24572018 3 9.2.
8、2 液化明胶试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.1的规定执行，菌落周围有明显的透明圈为阳性。 9.2.3 硫酸软骨素试验 用硫酸软骨素-Shieh培养基，即含400 g/mL的硫酸软骨素溶液和1%的牛血清白蛋白组分V的Shieh 培养基制平板（配置方法见附录A.2）, 冷却后用灭菌牙签点种供试菌株,培养48h 后在通风厨内向平板 倒入4mol/L的冰乙酸浸没培养基, 10min后菌落周围有明显的透明圈为阳性。 9.2.4 刚果红试验 配制刚果红-Shieh 培养基（配置方法见附录A.3）,用牙签点种供试菌株, 25C 培养48h,平板上菌 落呈深红色为阳性。 9.2.5 托普霉素生长试
9、验 配制终浓度为1g/mL 的托普霉素-Shie h 培养基（配置方法见附录A.4），25 C 培养48h，有黄色 假根状菌落生长的判断为阳性。 9.2.6 酪素水解试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.2的规定执行，有酪素水解亮斑为阳性。 9.2.7 淀粉水解试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.3的规定执行，有明亮水解区域的为阳性。 9.2.8 七叶灵水解试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.4的规定执行。菌落周围有黑色沉淀物为阳性。 9.2.9 氧化酶试验 按 SC/T 7213 中7.8的规定执行。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性，不变色为阴性。 9.2.10 运动性 按
10、 SC/T 7213 中7.16的 规定执行。若接种细菌由穿刺线向四周扩散， 其边缘呈云雾状，为运动性 阳性；若接种细菌只生长在穿刺线上，边缘清晰，为运动性阴性。 9.3 16S rRNA 基因序列测定与同源性分析 9.3.1 细菌基因组 DNA 抽提 取2mL待检菌培养液， 12000r/min离心1min， 收集菌体。 菌体悬浮于500 L TE缓冲液 （pH8.0） （A .5） ， 震荡悬浮，加入50 L 10的SDS溶液（A .6），10 L 20mg/mL的蛋白酶K（A .7），混匀，37温育1h。 加入100 L 5mol/L的NaCl溶液（A .8），充分混匀，再加入100 L
11、 CTAB/NaCl溶液（A .9）混匀，65温 育20min。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（A .10），混匀，12000r/min离心5min。取上清 液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A .11），混匀，12000r/min离心5min。取上清液，加入1倍体 积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000r/min 离心10min；沉淀用70酒精洗涤2次，室温晾干。 加入50 L的TE缓冲液溶解，-20贮存，备用。 DB51/T 24572018 4 9.3.2 16S rRNA 基因扩增 PCR反应体系： 10 PCR缓冲液（无Mg 2+ ）5.0 L，M
12、gCl 2（25mmol/L）5.0 L，dNTP s（10mmol/L）1.0 L， 引物(20 mol/L)P-F和P-R各1.0 L，Taq DNA酶（5U/ L）0.5 L，DNA模板1.0 L，无菌双蒸水补足致50 L。 混匀后，3000r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。 PCR反应条件：94预变性5min；94变性1min， 54退火1min，72延伸1min，35次循环；72 延伸10min； 4保温。 9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A.12）配制1的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没 胶面。将上述6
13、L样品和2 L溴酚蓝指示剂溶液（A.13）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物 作对照。120V电泳约20-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察，并在长波紫外灯下用刀片 切下含目的条带（约1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。 9.3.4 PCR 扩增产物纯化、测序、序列比对 9.3.4.1 PCR 扩增产物纯化 9.3.4.1.1 按每 0.1g 琼脂糖凝胶加 0.1mL 酚，将酚加入 9.3.3 含有目的条带胶块的离心管中。 9.3.4.1.2 经漩涡震荡仪震荡 1min-2min，将离心管在-70放置 1h，使凝胶完全冻结。 9.3.4.1.3 37水浴将冻结
14、的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡 1min-2min；14 000r/min 离心 5min。 9.3.4.1.4 取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25241） （A.10）， 混匀，12000r/min 离心 5min。 9.3.4.1.5 取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A.11），混匀，1 2000r/min 离心 5min。 9.3.4.1.6 向收集的水溶液中加入 1/10 体积的 3mol/L 的乙酸钠和 2 倍体积的无水乙醇， 置-20过夜 或-70放置 1h-2h。 9.3.4.1.7 14000r/min 离心 10min，弃上清。
15、9.3.4.1.8 将沉淀的 DNA 溶于适当体积的 TE 缓冲液（A.5）中，置-20保存，待测。 9.3.4.2 PCR 扩增产物测序与同源性分析 将9.3.4.1纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列（附录B）进行比对分析。 9.4 组织病理学检测 采集小于1cm厚的病变鳍条、体表皮肤、心、肝、脾、肾，参照GB/T 28630.4步骤5制作石蜡切片及 染色。 10 结果判定 10.1 菌落形态 在Shieh培养基上培养24-48h，呈现黄色，边缘不整齐，中间凸起的假根状菌落。 10.2 细菌染色 革兰氏染色为革兰氏阴性，菌体细长、弯曲或直的杆状，约(48)m(0.50.7)m 1
16、0.3 生理生化特性 DB51/T 24572018 5 生理生化反应试验结果见表1。 表1 柱状黄杆菌生理生化反应结果 项目 结果 项目 结果 葡糖糖利用 酪素水解试验 + 液化明胶 + 淀粉水解试验 硫酸软骨素试验 + 七叶灵水解试验 刚果红试验 + 氧化酶试验 + 托普霉素生长试验 + 运动性 + 注：“+”代表阳性；“”代表阴性。 10.4 16S rRNA 序列测定与同源性分析 测定的16S rRNA基因序列与附录B所列的基因序列比较，同源性达96%以上。 10.5 组织病理学表现 光学显微镜下，在体表病变组织上可见大量成簇状排列的细长、弯曲或直的杆状细菌。 11 综合判定 符合以下
17、所有特征者判定为斑点叉尾鮰柱形病： a) 临床症状与 6 相符； b) 菌落形态和染色观察与 10.1 和 10.2 相符； c) 生理生化反应结果与 10.3 相符； d) 16S rRNA 基因序列同源性分析结果与 10.4 相符； e) 组织病理学与 10.5 相符。 DB51/T 24572018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配方 A.1 Shieh培养基 蛋白胨 5g 酵母粉 0.5g CH3COONa.3H2O 0.01g BaCl2.2H2O 0.01g K2HPO4 0.1 g KH2PO4 0.05 g MgSO47H 2O 0.3g CaCl22H 2O 0
18、.0067 g FeSO47H 2O 0.001 g NaHCO3 0.05g 加蒸馏水至1L，调pH至 7.2，于121灭菌20min A.2 硫酸软骨素- Shieh 培养基 配制Shieh 培养基，于121灭菌20min，冷却至37后加入4 mg/mL 的硫酸软骨素溶液和5%的牛血 清白蛋白组分V，使两者终浓度分别为400 g/mL和1%，制平板。 A.3 刚果红-Shieh 培养基 配制Shieh培养基，于121 灭菌20min，冷却至37后加入刚果红，使终浓度为30-50 mg/mL。 A.4 托普霉素-Shieh培养基 配制Shieh培养基，于121灭菌20m in，冷却至37后加
19、入托普霉素，使终浓度为1 g/mL。 A.5 TE缓冲液（pH8.0） 将0.121g Tris碱（分子量121.1），0.0 372g乙二胺四乙酸二钠（分子量372.24）加入80mL双蒸水 中，加浓盐酸调节pH至8.0，加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.6 10SDS溶液 将10g十二烷基硫酸钠加入80mL双蒸水中， 加热至68助溶， 再加入双蒸水定容至100mL， 室温保存。 A.7 蛋白酶K（20mg/mL） DB51/T 24572018 7 将蛋白酶K溶解于双蒸水中，至终浓度20mg/mL，分装入小管，置-20保存。 A.8 5mol/L的NaCl溶液 将29.22g Na
20、Cl（分子量58.44 ）溶解于80mL双蒸水中，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.9 CTAB/NaCl溶液 4.1g NaCl溶解于80mL双蒸水中，缓慢加入1 0g CTAB，再加双蒸水定容至100mL，室温保存。 A.10 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） 将25体积的酚、24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE 缓冲液，4保存。 A.11 氯仿：异戊醇（24:1） 将24体积的氯仿和1体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中。 A.12 50TAE电泳缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加入28.55mL冰乙酸和5
21、0ml 0.5/L EDTA。再加双蒸水定容至 500mL，室温保存。使用时，配成1 TAE电泳缓冲液。 A.13 溴酚蓝指示剂溶液 6 上样缓冲液 将溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。 待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴 酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL，加入NaOH溶液1滴，调至蓝色。 DB51/T 24572018 8 B B 附 录 B （资料性附录） 柱状黄杆菌 16S rRNA 基因参考性序列（1477bp） 1 agagtttgat catggctcag gatgaacgct agcggcaggc ttaacacatg caagtcgagg 61 ggt
22、agaagga gcttgttcct ttgagaccgg cgcacgggtg cgtaacgcgt atgcaatcta 121 ccttgtacag ggggatagcc cagagaaatt tggattaata ccccatagta ttttcagatg 181 gcctcatttg attattaaag ttccaacggt acaagatgag catgcgtccc attagctagt 241 tggtgtggta acggcatacc aaggcaacga tgggtagggg tcctgagagg gagatccccc 301 acactggtac tgagacacgg a
23、ccagactcc tacgggaggc agcagtgagg aatattggtc 361 aatgggcgca agcctgaacc agccatgccg cgtgcaggat gacggtccta tggattgtaa 421 actgcttttg tacaggaaga aaccctccct tgtaagggag cttgacggta ctgtaagaat 481 aaggatcggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gaggatccaa gcgttatccg 541 gaatcattgg gtttaaaggg tccgtaggcg gttttataag
24、 tcagtggtga aatctggtcg 601 ctcaacgatc aaacggccat tgatactgta agacttgaat tacttggaag taactagaat 661 atgtagtgta gcggtgaaat gcttagagat tacatggaat accgattgcg aaggcaggtt 721 actacgagta tattgacgct gatggacgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 781 tgtattccaa cgcccgtaaa cggtggatac tagctgtttg gagcaatctg agtggnta
25、ag 841 cgaaagtgat aagtatccca cctggggagt acgttcgcaa gagtgaaatt caaaggaatt 901 gacgggggcc cgcacaagcg gaggagcatg tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct 961 taccanggct taaatgggaa acgacagatt tggaaacagt ctttcttcgg acgtttttca 1021 aggtgctgca tggttgttgt cagctcgtgc cgtgaggtgt caggttaagt cctataacga 1081 gcgcaacccc
26、tgttgctagt tgccagcgag tcatgtcggg aattctagca agactgccgg 1141 tgcaaaccgc gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca cggcccttac gccttgggct 1201 acacacgtgc tacaatggac ggtacagaga gcagccacta cgcaagtagg agcgaatcta 1261 caaaaccgtt ctcagttcgg atcggagtct gcaactcgac tccgtgaagc tggattcgct 1321 agtaatcgca gatcagccat gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1381 gtcaagccat ggaagctggg ggtacctgaa gtcggtgacc gcaaggagct gcctagggta 1441 aaactggtaa cttaggctaa gtcgtaacaa ggtaacc _ DB51/T 24572018
