1、 ICS 65.020.40 B 61 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24042017 大熊猫种群遗传档案建立技术规程 2017 - 09 - 19 发布 2017 - 10 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 24042017 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 遗传标记 选用原则 . . 1 5 实验流程 . . 2 6 线粒体标记 P CR 方法 . . 2 7 大熊猫性 别鉴定的方法 . . 3 8 微卫星标 记使用方法 . . 4 9 遗传档案 数据的管理和使用 . .
2、 5 附录 A（规范性附录） 大熊猫微卫星标记编号、名称、来源及 PCR 扩增引物 . 6 DB51/T 24042017 II 前 言 本标准根据:GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规定编写。 本标准由四川省林业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川省野生动植物资源保护管理站。 本标准主要起草人：岳碧松、魏辅文、张和民、沈富军、杨旭煜、古晓东。 DB51/T 24042017 1 大熊猫种群遗传档案建立技术规程 1 范围 本标准规定了建立圈养大熊猫和野生大熊猫遗传档案的技术规程。 本标准适用于四川省圈养大熊猫和野生大熊猫遗
3、传档案建立。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB51/T 2288-2016 野生大熊猫种群动态监测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 微卫星序列 microsatellite sequence 是指基因组中由1-6个核苷酸为基本重复单元组成的DNA串 联重复序列，例如（AC）n、（ACG）n、 （ATTT ） n等， 也称为短串联重复序列 （Short tandem repeats， STR） 或简单重复序列 （S
4、imple sequences repeats，SSR）。在个体间重复次数发生变化的多态性微卫星位点，可以作为微卫星标记使用。 3.2 DNA 样品 DNA samples 是指利用大熊猫组织（如毛发、血液、精液、肌肉组织等）或新鲜粪便提取的大熊猫基因组 DNA。 4 遗传标记选用原则 4.1 线粒体标记 大熊猫线粒体控制区PCR扩增引物(Zhang et al. 2007): P-tp (5-CTC CCT AAG ACT CAA GGA AG-3) BEDH (5-GGG TGA TCT ATA GTG TTA TGT CC-3) PCR扩增产物长度为750bp左右。 4.2 性别鉴定分子
5、标记 优先使用大熊猫锌指蛋白基因（ZF）PCR扩增引物（Xu et al., 2009） ： GTf, 5-CAAGGATTTCCATGTAGCAGT-3 ； GTr, 5-ACTCTCCACAATGTCTACGGT-3 DB51/T 24042017 2 如果用上述引物对某些样品扩增困难，可采用以下2对引物进行组合扩增（Zhan et al., 2006; 詹 祥江, 2006）: 扩增Y染色体SRY基因的ZX1引物，产物片段大小210bp： ZX1-F：5 - CTACATAGCCCCAACCCCTTTTC -3 ZX1-R：5 - GGTTCTGGCCGCTGTCTCTACTAT -3
6、扩增X染色体ZFX基因的引物，产物片段大小130bp，用于区分扩增失败与鉴定为雌性的情况： ZFX-F：5 - ATAATCACATGGAGAGCCACAAGCT -3 ZFX-R：5 - CTCCTTTTTCCTTATGCACC -3 4.3 微卫星标记 在进行圈养大熊猫和野生大熊猫微卫星相关工作时（包括个体识别、亲子鉴定、种群遗传管理、种 群监测、种群遗传多样性评估、种群遗传档案等），统一推荐使用30个微卫星标记（附录A），其中1-15 号为基本标记，16-30号为备选标记，可根据工作目标选用合适数量的微卫星标记。只有当基本标记不 够用时，才使用备选标记。 5 实验流程 5.1 线粒体标记
7、扩增 使用4.1规定的线粒体标记引物对每个DNA样品进行PCR扩增，各取PCR产物2-5L，用浓度为1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳来检测是否扩增成功，只有当PCR 扩增成功的样品才进入后续分析。若两次提取、两 次扩增均不能成功，说明DNA质量不符合要求，应该放弃该样品的后续分析。 5.2 微卫星分型 只对线粒体标记PCR扩增成功的样品进行微卫星标记分型检测； 从1-15号微卫星标记中选用6-8个标记对样品进行个体识别； 在个体识别基础上， 根据研究目标从基本标记中选用更多标记对不同个体的DNA样品进行PCR扩增和 扫描分型； 如有多份DNA样品来自同一个体，选一份或多份参加后续分析，但必须注明样
8、品编号，不要混合使 用； 5.3 性别鉴定 使用4.2规定的性别鉴定分子标记引物对不同个体的DNA样品进行PCR性别鉴定。 6 线粒体标记 PCR 方法 6.1 引物合成 将4.1规定的大熊猫线粒体控制区PCR扩增引物序列送有关公司合成。 6.2 PCR 扩增体系及程序 DB51/T 24042017 3 10PCR buffer 2.0L MgCl2 (25mmol/L) 2 0L dNTP (2.5mM) 1.0L Taq polymerase (2.5U/L) 0.2L 引物-F （15pmol/L） 1.0L 引物-R（15pmol/L） 1.0L 模板DNA 2.0L ddH2O 1
9、0.3L BSA (1mg/mL) 0.5L 合计 20L PCR扩增程序： 94预变性5分钟； 然后在PCR扩增仪上进行40个循环。 每个循环为94变性 50 s, 55 退火45 s,72 延伸50s；最后在72延伸10 分钟。PCR产物在4中保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝 胶电泳检测合格后送公司测序。 7 大熊猫性别鉴定的方法 7.1 PCR 扩增引物的合成 将4.2规定的大熊猫性别鉴定PCR扩增引物序列送有关公司合成。 7.2 PCR 扩增体系及程序 10PCR buffer 2.0 L MgCl2 (25 mmol/L) 2 L dNTP (2.5mM) 1.0 L Taq po
10、lymerase (2.5U/L) 0.2L 引物-F （15 pmol/L） 0.8 L 引物-R（15 pmol/L） 0.8L 模板DNA 2L ddH2O 10.4 L BSA (1mg/mL) 0.8 L 合计 20 L PCR扩增程序：95预变性5分钟；每个循环为94变性 50 s, 59退火45 s, 72 延伸1 min， 35个循环；最后在72 延伸10 min；4保存。 7.3 电泳检测 当PCR扩增完成后，每个样本PCR产物均先各取5 L，用浓度为2 %的琼脂糖凝胶电泳(100 V,25 min) 检测扩增结果。 DB51/T 24042017 4 7.4 性别判读 当扩
11、增锌指蛋白基因时，PCR扩增所得产物片段长度为135bp和3 54bp，其中长度为354bp的片段来自 X染色体，长度为135bp的片段来自Y染色体，即雌性样品扩增得到一个354bp的片段，而雄性样品扩增得 到135bp和354bp两个片段。因此，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条带的是雄性，出现一条带 的是雌性。 当同时扩增锌指蛋白基因和SRY 基因时，PCR扩增所得产物片段长度为1 30bp和210bp，其中长度为 130bp的片段来自X染色体，长度为210bp的片段来自Y染色体，即雌性样品扩增得到一个130bp的片段， 而雄性样品扩增得到130bp和210bp两个片段。因 此，PC
12、R产物经琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条带的是 雄性，出现一条带的是雌性。 8 微卫星标记使用方法 8.1 PCR 引物的设计、合成与荧光标记 推荐使用的30个微卫星标记的PCR引物序列设计参见附录A，将序列送有关公司合成，详细记录引物 合成的生物公司名称，合成的批次及每个引物标记的颜色，方便后续做系统误差校正。 8.2 PCR 扩增的反应体系和扩增程序 10PCR buffer 2.0 L MgCl2 (25mmol/L) 2.0 L dNTP (2.5mM) 1.0 L Taq polymerase (2.5U/L ) 0.2L 引物 -F （ 15 pmol/L ） 0.5L 引物 -R（
13、15pmol/L ） 0.5L 模板 DNA 2.0L ddH2O 11.0 L BSA (1mg/mL) 0.8 L 合计 20 L PCR扩增程序：95预变性5分钟，然后35个循环包括94变性 50 s, 55-65（根据不同的引物 确定）退火45s, 72 延伸30s，最后在72 延伸10分钟。 8.3 PCR 产物的质量检测 当PCR扩增完成后，取PCR产物5L，经1.5 %-2%琼脂糖凝胶电泳检测，如电泳条带清楚、片段大小 正确，表明PCR扩增成功； 将符合质量要求的PCR产物避光（使用锡箔纸盒）存放于4冰箱，用于基因分型； 对于不符合质量要求的样品，要进行PCR条件优化，重新进行P
14、CR扩增和质量检测； PCR条件的优化主要是通过改变Mg 2+ 的浓度、退火温度以及增加DNA的用量等进行。 8.4 基因分型 将符合质量要求的PCR产物送有关公司进行基因扫描分型； DB51/T 24042017 5 为了消除系统误差，所有样品均送同一家公司、使用同一型号分型设备进行基因分型，所有批次都 选用相同分子内标，并且使用同一数据判读软件进行数据判读。如果基因分型的结果峰图影响数值的读 取，应重新进行PCR扩增和基因分型，直至获得高可信度的基因分型结果。 为了获得更加可信的基因型，最好采用多管PCR（multi-tube approach）扩增方案。 8.5 个体识别 用Micros
15、atelli te tools软件根据微卫星位点的分型数据进行个体识别； 当两个或两个以上的样品微卫星标记分型结果完全一致时，判定样品来自同一个体； 当两个样品的微卫星标记分型结果中有两个及以上标记分型结果不同时，判定样品来自不同个体； 当两个样品的微卫星标记分型结果中只有一个 标记差异时，对出现差异的位点重复PCR扩增和基因 分型，以进一步确认； 9 遗传档案数据的管理和使用 9.1 分子标记的使用 对圈养大熊猫或野生大熊猫进行个体识别、亲子鉴定、性别鉴定、遗传档案建立和种群遗传多样性 评估、种群遗传管理时，应统一使用本标准规定的分子标记； 9.2 数据管理 分子标记应用获得的所有数据必须汇
16、总到四川省林业厅，统一建立大熊猫遗传档案数据库；各保护 区有权要求获得本保护区相关数据，并妥善保存。 9.3 数据的应用 大熊猫遗传档案数据的使用和对外公布应由四川省林业厅批准，并征得数据利益各方同意；必要时 由四川省林业厅委托有关单位对数据进行统一分析，并编写进展报告。 DB51/T 24042017 6 A A 附 录 A （规范性附录） 大熊猫微卫星标记编号、名称、来源及 PCR 扩增引物 编号 标记名称 引物序列（53） 大小(bp) 参考文献 1. Ame-10 F: ACCGTGCTCTTAATCCCCTT R: CCCATGCTTATGAGAAACAGG 138-160 Lu e
17、t al. 2001 2. Ame-11 F: TATGCCACCTGCCCAGAC R: GATGGAAAGAGTAGAGCCAAGG 228-236 Lu et al. 2001 3. Ame-13 F: GGAAGCATTAAGGAAAACATGC R: AATGATGACCATTTCAAACGC 142-171 Lu et al. 2001 4. Ame-15 F: AAGCAGTTGTTTTTGCTTAGTG R: TGTCAAAGTATTTGCCTCACA 122-130 Lu et al. 2001 5. Ame-22 F: AGGAAACATGTTGCCTTTTCA R: AG
18、AGGGCAAATAGGAGGGAA 127-129 Lu et al. 2001 6. gpz-6 F: CCTGGCAGGGCAAAGTATT R: CCCCGTGAAAACATCAAGAC 194-222 Huang et al. 2015 7. gpz-47 F: GACCTCAGTGTACGCCCAGT R: CTGGACAGGCAGGTAGAAGC 174-210 Huang et al. 2015 8. gpz-20 F: CCCTCTCGTTGTGTCTCTCTG R: CACCTGGTAAATGGCACCTT 258-326 Huang et al. 2015 9. gpz-
19、51 F: GGGGAGGATATGTGTTGTGG R: TGCTTTGGATTTATTGGAGCA 163-179 Huang et al. 2015 10. GPL-29 F: TCCAAGGCTTCAAACAAGGT R: CACCACAGGTGCCAATTATG 155-179 Huang et al. 2015 11. GPL-60 F: TGCCGGAAAGTTCTAAGCAT R: TTTCTCTCCCTCTCCCCTTC 218-238 Huang et al. 2015 12. GPL-8 F: TGGTTTTGCAAGGATGACAG R:TTGTGACAAGCAAGCT
20、CCAC 224-236 Huang et al. 2015 13. GPL-28 F: GAAAGAAGGGCAGGGATAGG R: TGACCAAGAACTCACGGTTG 186-194 Huang et al. 2015 14. gpy-5 F: CTCGGGAGCTTTGTACCATC R: CAGAGAGCCCAAACCTCAAC 200-212 Huang et al. 2015 15. gpy-20 F: GCAGGCACTCAAGAGGTGTT R: CCTTGTGCTAAACACAGGTGA 149-165 Huang et al. 2015 16. GPL-53 F:
21、CCAGAAAATGGCTTTCATGC R: TCTCTTTCTCTGCCCCACAC 150-174 Huang et al. 2015 17. GPL-44 F: TTCTCCCTCTGTCTGCCACT R: ACCATTCTGGGTGCGATAAC 172-184 Huang et al. 2015 DB51/T 24042017 7 18. Panda-06 F: AGGCAGATTTCCCACAGAGAGC R: GGTGGGCAGGAATGATTGGGC 159-163 沈富军等 2005 19. Panda-22 F: AGGGGAGAGAACATTGCTCG R: GAAG
22、CCAGCCCAACTTTTCC 177-186 沈富军等 2005 20. Panda-05 F:GCAAGGATTCATAACGGTAGGG R:GTGTCTTGACCACCAGTGATGTAAGCCG 98-108 沈富军等 2005 21. Panda-40 F:CCTACCTATTTACCTACTTACCTACC R: GATGCTATTAAGCAACAGAC 119-129 沈富军等 2005 22. Panda-44 F: TATCAGGCTCTGTGCTCAGC R: GTTTGGTCTTCTCCAGTGGC 230-278 沈富军等 2005 23. Panda-45 F:
23、AGGCAGATTTCCCACAGAGAGC R: GGTGGGCAGGAATGATTGGGC 159-163 沈富军等 2005 24. Ame-24 F: ATGCATGACATTTTGGGTAGC R: TGAAGACCCTAGATGAAGGCA 248-258 Lu et al. 2001 25. Ame-26 F: TTTTCAGGCCTCCGAAAAC R: ATTCCCAATAAAGCAAATCAGA 114-120 Lu et al. 2001 26. GP-01 F: ACGGGAAGCCTGCTTCTACACTC R: AGACACCCAACCGACTAAACCAC 144
24、-152 张亚平等 1995 27. GP-08 F: AACATCCTGGGTATTCTCCATGC R: TGCAGAGTGAGGACCTAGGTGTC 154-160 张亚平等 1995 28. GP-901 F:AGCTAATTTTCCAAGTTACCTTTCC R: GGATCTGGGTGTTATTTGCAATG 156-164 张亚平等 1995 29. GPL-31 F: GCATCCTTGTCCTCTTGGAG R:GCATTGTTTTCTACTCTACAAATATCC 127-147 Huang et al. 2015 30. GPL-47 F: TCCCCCTCTATGGTAAAAGG R: CCATGTTGGGTGTAGGGATT 140-172 Huang et al. 2015 _ DB51/T 24042017
