1、ICS DB51 四川省地方标准 DB 51/ XXXXX2013 杂交水稻品种纯度 SSR 分子检测方法 （报批稿） 2013 - XX - XX 发布 2013 - XX - XX 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/ XXXXX2013 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 原理 . . 2 5 主要的仪器设备 . . 2 6 试验方法 . . 2 7 引物筛选 . . 2 8 检测步骤 . . 2 9 纯度结果计算 . . 3 附录 A（规范 性附录） 主要试剂配制 . 4 附录 B（规范性附录）
2、常用 SSR 引物. . 5 DB51/ XXXXX2013 II 前 言 本标准附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准负责起草单位：四川省种子站。 本标准主要起草人： 毛双林、周会、吕季娟、谭功燮、高宏、韩本达、秦洁。 DB51/ XXXXX2013 1 杂交水稻品种纯度 SSR 分子检测方法 1 范围 本标准规定了杂交水稻品种纯度的SSR分子检测方法。 本标准适用于水稻杂交种的纯度鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期
3、的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GBT 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 NY/T 1433 水稻品种鉴定 DNA指纹方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 品种纯度 varietal purity 品种个体与个体之间在DNA 分子标记带型方面典型一致的程度， 用本品种的种子数占供检验本作物 种子数的百分率表示。 3.2 简单重复序列 SSR simple se quence repeats 由16个核苷酸为重复单位组成的简单串联重复序列。 3.3 聚合酶链式反应 PCR poly merase chain reaction 在DNA聚合
4、酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤， 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程 。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外 扩增目的DNA。 3.4 引物 primer 具有游离的3 -OH末端及特定序列的寡核苷酸短片段，与DNA模板结合，在DNA聚合酶作用下启动PCR 反应，延伸合成模板DNA 的互补链。 DB51/ XXXXX2013 2 3.5 核心引物 core primer 多态性、稳定性、重复性等综合特性好，适用于杂交水稻品种纯度鉴定优先选用的引物。 4 原理 简单重复序列（SSR）分布于水稻整个基因组， 品种间因其重复次
5、数不同而存在多态性，每个品种 均具备特异的分子标记图谱。 据此， 根据每个简单重复序列两端的高度保守序列设计特异引物， 利用PCR 技术进行扩增，从而检测特定SSR 位点的多态性，以鉴别水稻品种的纯度。 5 主要的仪器设备 PCR 扩增仪；电泳仪；电泳槽；胶片观测台；96 孔深孔板；96 孔PCR 板；电磁炉。 6 试验方法 参照NY/T 1433。 7 引物筛选 选择杂交种含有双亲互补带型，而且带型清晰、重复性好的引物作为PCR扩增引物。 筛选引物时，取待测杂交种种子10 粒及双亲种子各5 粒发芽，快速提取DNA,利用核心引物进行扩 增，从中确定该品种纯度检测最适宜的13对引物。 杂株为待测
6、杂交种的双亲时，1对引物即可满足检测要求；杂株为其他类型时，将引物对数增加至3 对以上。 适用于杂交水稻品种纯度鉴定的常用SSR引物名称、染色体位置及序列参见附录B。选择时，优先从 表B.1的核心引物中进行筛选。 8 检测步骤 8.1 发芽 从待测杂交水稻样品中随机数取不少于400粒种子，按GB/T 3543.4规定进行发芽，从发芽的幼苗中 随机剪取不少于200株幼苗供检。 8.2 DNA 快速提取 待幼苗长至3cm5cm左右（种子置床后45 天），剪取0.5cm长的水稻幼苗茎秆中部，用镊子放入 96孔深孔板中，每孔加入40ul DNA 提取液I，沸水煮45秒 ，取出，每孔加入60ul DNA
7、提取液II,沸水煮2 分钟，取1ul用作模板。每个待测样品提取24个96 孔板的单株DNA。纯度低于97.0%的样品将待测单株 数增加至300株以上。 DNA提取液的配制参照附录A。 8.3 引物筛选 DB51/ XXXXX2013 3 从常用引物中筛选13对最适宜该品种的引物，所选引物的 SSR 电泳谱带须含双亲互补谱带，且 PCR重演性好、电泳易于分离、谱带清晰、亮度高。 8.4 PCR 扩增 用筛选出的13对引物分别扩增待测样品DNA，PCR扩增体系为：模板1ul，2 Tag PCR Mix 5ul， 10umol/L正、反向引物各0.5ul，加入灭菌蒸馏水补足10ul。 PCR扩增程序
8、为：94预变性5分钟；94变性45秒，55退火45秒，72延伸1分钟，循环35 次； 72延伸8分钟；10恒温冷却。 8.5 非变性聚丙烯酰胺电泳 按照NY/T 1433进行点样、电泳、染色、读带。 9 纯度结果计算 鉴定电泳谱带的特征和一致性，计数待测样品幼苗株数和非本品种幼苗株数，并按下列公式计算品 种纯度（ X），以百分率表示： A B X（ %） = 100 .(1) A 式（1）中： A 待测样品幼苗株数； B 非本品种幼苗株数。 测定结果的有效位数保留一位有效数字。 DB51/ XXXXX2013 4 A A 附 录 A （规范性附录） 主要试剂配制 A.1 2.5mol/L HC
9、l: 加 25ml浓HCl到 91ml蒸馏水中，于室温保存。 A.2 1mol/L Tris-HCl（pH 8.0） ：取三羟甲基氨基甲烷(Tris) 60.55g溶于适量蒸馏水中，用盐酸(HC l)调pH至 8.0，加水定容至 500mL，高压灭菌。 A.3 DNA提取液I: 取NaOH 1g ，先用 80mL蒸馏水溶解后，再加水定容至 100mL。 A.4 DNA提取液II: 取 8ml 2.5mol/L的HCl,20ml 1mol/L Tris-HCl（pH 8.0） ，500ul IGEPAL-CA630， 加灭菌蒸馏水定容至 120ml。 A.5 引物：用超纯水溶解引物至终浓度为 1
10、0mol/L。 A.6 凝胶与电泳试剂配制：按照NY/T 1433 进行配制。 A.7 银染试剂配制：按照NY/T 1433 进行配制。 DB51/ XXXXX2013 5 B B 附 录 B （规范性附录） 常用 SSR 引物 表B.1 杂交水稻品种纯度分子检测核心 SSR 引物 位置 序号 标记 染色体 （ cM） 正向引物序列 反向引物序列 1 RM297 1 32093949 tctttggaggcgagctgag cgaagggtacatctgcttag 2 RM71 2 8760537 ctagaggcgaaaacgagatg gggtgggcgaggtaataatg 3 RM85
11、 3 36341095 ccaaagatgaaacctggattg gcacaaggtgagcagtcc 4 RM5414 4 2021760 accatggttcaagagtgaaa acagctcaacctgttgagtg 5 RM274 5 26848153 cctcgcttatgagagcttcg cttctccatcactcccatgg 6 RM190 6 1764740 ctttgtctatctcaagacac ttgcagatgttcttcctgatg 7 RM336 7 21871337 cttacagagaaacggcatcg gctggtttgtttcaggttcg 8 R
12、M72 8 6762710 ccggcgataaaacaatgag gcatcggtcctaactaaggg 9 RM219 9 7887585 cgtcggatgatgtaaagcct catatcggcattcgcctg 10 RM311 10 9747442 tggtagtataggtactaaacat tcctatacacatacaaacatac 11 RM209 11 17808441 atatgagttgctgtcgtgcg caacttgcatcctcccctcc 12 RM19 12 2432080 caaaaacagagcagatgac ctcaagatggacgccaaga
13、 13 RM1195 1 6153019 atggaccacaaacgaccttc cgactcccttgttcttctgg 14 RM208 2 35135946 tctgcaagccttgtctgatg taagtcgatcattgtgtggacc 15 RM232 3 9754695 ccggtatccttcgatattgc ccgacttttcctcctgacg 16 RM273 4 23825125 gaagccgtcgtgaagttacc gtttcctacctgatcgcgac 17 RM267 5 2881434 tgcagacatagagaaggaagtg agcaacagc
14、acaacttgatg 18 RM253 6 5425498 tccttcaagagtgcaaaacc gcattgtcatgtcgaagcc 19 RM18 7 25651810 ttccctctcatgagctccat gagtgcctggcgctgtac 20 RM337 8 146952 gtaggaaaggaagggcagag cgatagatagctagatgtggcc 21 RM278 9 19320020 gtagtgagcctaacaataatc tcaactcagcatctctgtcc 22 RM258 10 18014268 tgctgtatgtagctcgcacc tg
15、gcctttaaagctgtcgc 23 RM224 11 27201740 atcgatcgatcttcacgagg tgctataaaaggcattcggg 24 RM17 12 26954814 tgccctgttattttcttctctc ggtgatcctttcccatttca DB51/ XXXXX2013 6 表B.2 杂交水稻品种纯度分子检测备选 SSR 引物 位置 序号 标记 染色体 （ cM） 正向引物序列 反向引物序列 1 RM423 2 3836866 agcacccatgccttatgttg cctttttcagtagccctccc 2 RM7389 3 361552
16、64 agcgacggatgcatgatc ttgagccggaggtagtcttg 3 RM567 4 34533716 atcagggaaatcctgaaggg ggaaggagcaatcaccactg 4 RM421 5 23976341 agctcaggtgaaacatccac atccagaatccattgacccc 5 RM176 6 30265439 cggctcccgctacgacgtctcc agcgatgcgctggaagaggtgc 6 RM432 7 18958599 ttctgtctcacgctggattg agctgcgtacgtgatgaatg 7 RM477 8
17、 28075160 tctcgcggtatagtttgtgc accactaccagcagcctctg 8 RM316 9 1075107 ctagttgggcatacgatggc acgcttatatgttacgtcaac 9 RM184 10 16358895 atcccattcgccaaaaccggcc tgacacttggagagcggtgtgg 10 RM332 11 2840361 gcgaaggcgaaggtgaag catgagtgatctcactcaccc 11 RM7102 12 13211362 taggagtgtttagagtgcca tcggtttgcttatacat
18、cag 12 RM488 1 24807508 cagctagggttttgaggctg tagcaacaaccagcgtatgc 13 RM1385 2 26640596 atgacaggtaaggtgtggtg tgaacatcatcttcgaatcc 14 RM231 3 2453256 ccagattatttcctgaggtc cacttgcatagttctgcattg 15 RM119 4 21242569 catccccctgctgctgctgctg cgccggatgtgtgggactagcg 16 RM413 5 2212736 ggcgattcttggatgaagag tcc
19、ccaccaatcttgtcttc 17 RM225 6 3416596 tgcccatatggtctggatg gaaagtggatcaggaaggc 18 RM180 7 5735274 ctacatcggcttaggtgtagcaacacg acttgctctacttgtggtgagggactg 19 RM152 8 682962 gaaaccaccacacctcaccg ccgtagaccttcttgaagtag 20 OSR28 9 19788251 agcagctatagcttagctgg actgcacatgagcagagaca 21 RM590 10 23043156 catc
20、tccgctctccatgc ggagttggggtcttgttcg 22 RM21 11 19173027 acagtattccgtaggcacgg gctccatgagggtggtagag 23 RM3331 12 23460827 cctcctccatgagctaatgc aggaggagcggatttctctc 24 RM490 1 6676230 atctgcacactgcaaacacc agcaagcagtgctttcagag 25 RM263 2 25865402 cccaggctagctcatgaacc gctacgtttgagctaccacg 26 RM8277 3 2880
21、5073 agcacaagtaggtgcatttc atttgcctgtgatgtaatagc 27 RM5473 4 31491515 accacaaacgatcgcgtc gagattaacgtcgtcctccg 28 RM598 5 16751191 gaatcgcacacgtgatgaac atgcgactgatcggtactcc 29 RM3628 6 23737158 aagaaaaagaatgccagatc agacacacccgtacctctag 30 RM542 7 12712074 tgaatcaagcccctcactac ctgcaacgagtaaggcagag DB51
22、/ XXXXX2013 7 位置 序号 标记 染色体 （ cM） 正向引物序列 反向引物序列 31 RM331 8 12294291 gaaccagaggacaaaaatgc catcatacatttgcagccag 32 RM566 9 14704798 acccaactacgatcagctcg ctccaggaacacgctctttc 33 RM333 10 22372129 gtacgactacgagtgtcaccaa gtcttcgcgatcactcgc 34 RM3133 11 6183053 tcaatagacacacgggcatg cgattttgctcactgcacag 35
23、RM277 12 18290458 cggtcaaatcatcacctgac caaggcttgcaagggaag 36 RM443 1 28339414 gatggttttcatcggctacg agtcccagaatgtcgtttcg 37 RM348 4 32650387 ccgctactaatagcagagag ggagctttgttcttgcgaac 38 RM551 4 177078 agcccagactagcatgattg gaaggcgagaaggatcacag 39 RM481 7 2875315 tagctagccgattgaatggc ctccacctcctatgttgttg 40 RM339 8 17942468 gtaatcgatgctgtgggaag gagtcatgtgatagccgatatg 41 RM583 1 8328860 agatccatccctgtggagag gcgaactcgcgttgtaatc 注：表B.2的引物序列及信息引自中国水稻所。 _
