1、 ICS 03.120.10 A 00 DB51 四川省地方标准 DB51/T 21692016 标准菌株的保存与使用指南 2016 - 05 - 18 发布 2016 - 10 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 21692016 I 目 次 前 言 . . II 引 言 . . III 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 标准菌株 获取与保存 . . 2 5 从标准菌株制备标准储备菌株/ 工作菌株 . . 2 6 从标准储备菌株制备储备菌株/ 工作菌株 . . 3 7 从储备菌 株制备工作菌株 . . 4 8 销毁 .
2、 . 4 9 记录 . . 5 附录 A（资料性附录） 部分已获认可的标准菌株提供者名录 . 6 附录 B（资料 性附录） 标准菌株制备流程图 . 7 参考文献 . . 9 DB51/T 21692016 II 前 言 本标准为实验室质量管理和技术运作类标准。 建议实验室将该标准与下列实验室质量管理和技术运 作系列标准结合起来使用。 微生物检测领域培养基和试剂的验证 微生物检测领域培养基和试剂的管理 微生物检测实验室安全管理指南 微生物检测实验室设施和环境条件监测指南 微生物检测实验室废弃物处置指南 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则进行起草。 本标准由四川省产品质量监督检验检测
3、院提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准由四川省产品质量监督检验检测院负责解释。 本标准起草单位：四川省产品质量监督检验检测院，成都市食品药品监督管理局,四川省食品药品 检验检测院，成都市疾病预防控制中心 本标准主要起草人：时炜，郑卫东，黄薇，胡丹，黄瑛，文永勤。 DB51/T 21692016 III 引 言 标准菌株是微生物检测结果溯源的有效途径之一，广泛应用于培养基（试剂）验收、方法确认/证 实、试验阳性/阴性对照、人员培训考核和结果的质量保证等方面。标准菌株的溯源性与稳定性，对于 确保微生物试验结果的准确性，具有重要作用。 本标准提出标准菌株的保存与使用指南，旨在为实
4、验室提供管理的科学路径，以满足相关要求。 本标准由范围、规范性引用文件、术语及定义、标准菌株、从标准菌株制备标准储备菌株/工作菌 株、从标准储备菌株制备储备菌株/工作菌株、从储备菌株制备工作菌株、销毁、记录和一个资料性附 录构成。 DB51/T 21692016 1 标准菌株的保存与使用指南 1 范围 本标准规定了标准菌株的保存和使用要求。 本标准适用于属于本标准定义的标准菌株的管理。 实验室其它途径获得的、不属于本标准定义的菌株，其管理可参考本标准执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其
5、最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 DB51/T 2158 实验室服务和供应品采购管理指南 DB51/T 2165 微生物检测领域培养基和试剂管理指南 3 术语和定义 GB 4789.28 界定的以及下列术语和定义适用于本标准 。 3.1 标准菌株 reference strain 直接从官方菌种保藏机构获得并至少定义到属或种的水平的菌株,按菌株特性进行分类和描述。 注1： 标准物质是指在均一固定的浓度中含有具活性的定量化菌种。 注2： 经证明的标准物质是指其浓度已经证明。 3.2 标准储备菌株 referenc e stocks 将标准菌株在实验室转接一代后得到的一套与标准菌株完全相
6、同的独立菌株。 3.3 储备菌株 stock culture 从标准储备菌株转接一代获得的培养物。 3.4 工作菌株 working culture 由标准储备菌株、储备菌株或标准菌株转接一代获得的菌株。 3.5 代 generation DB51/T 21692016 2 将微生物接种至一新鲜培养基上或其中，每萌发一次即称为一代。 4 标准菌株获取与保存 4.1 标准菌株的获取途径 4.1.1 菌种收藏所(NCTC)、中国医学菌种保藏管理中心（CMCC）、中国普通微生物菌株保藏管理中心 （CGMCC）、中国药学微生物菌种保藏管理中心（CPCC)、中国兽医微生物菌株保藏管理中心（CVCC）、
7、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)等。 注： 上述已获得认可的标准菌株提供者中英文名称对照见附录A。 4.1.2 如从商业机构获得标准菌株，应有标准菌种的保藏机构名称缩写及菌种编号，如大肠埃希氏菌 ATCC 25922、肠炎沙门氏菌 CM CC（B）50040、嗜水气单胞菌 AS1.1814 等。 4.1.3 从上级机构下发的质控盲样中分离出的菌株，被证明结果是正确的、且从考核机构获得该菌种 的保藏机构名称缩写及菌种编号的，也可作为标准菌株使用。 4.2 购买 应从行业内广泛认可的菌种收集途径获取标准菌株，如从标准菌种保藏中心或其他有效的、经过认 证的商业机构获得原包装的标准菌株。 4
8、.3 验收 实验室应制定标准菌株验收控制程序，确保所获取的标准菌株满足要求。 4.4 保存 通常情况下，应按照制造商提供的使用说明进行保存。 注： 未开启原包装的标准菌株通常视为第0代。 5 从标准菌株制备标准储备菌株/工作菌株 5.1 复苏 拆开标准菌株的包装，按说明书的要求，将标准菌株转种于适当的培养基内，于适当温度下培养适 当时间，进行复苏。 注1： 通常将标准菌株悬浮于营养肉汤中进行复苏。对冻干菌种，复苏操作可能较为繁琐。 注2： 经过一步复苏的菌株为第1代菌株。 5.2 平板分离 应按照制造商提供的使用说明，采用合适的非选择性平板对复苏的标准菌株进行分离，于适当温度 下培养适当时间。
9、 注1： 通常采用5%的血琼脂、TSA或其他适合的固体培养基进行分离，以获得特性稳定的菌株。 注2： 在平板上分离的菌株为第2代菌株。 5.3 确认 DB51/T 21692016 3 应对平板分离出的菌落进行确认。确认的内容包括存活性、纯度，实验室中所需要的其他关键特征 指标（如菌落形态、革兰氏染色、生化试验、血清学实验等）。记录确认的结果并予以保存。 5.4 制备标准储备菌株 5.4.1 在开展确认试验的同时，挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液，分装于菌株保存容器中，需 同时制备多份。需对每一支菌种保存容器进行适当标识，标识内容包括名称、菌种号、接种日期和所传 代数等信息。 注1： 若确认
10、试验不合格，则将制备的标准储备菌株弃去。 注2： 制备菌悬液时，若需低温保存，应加入保护剂。如果采用-70低温冻存，可在TSB中添加10%-15%的甘油作为 冷冻保护剂。 5.4.2 根据菌株的特性，选择使用冻干保藏、利用多孔磁珠在-70冰箱、液氮罐或其他有效的保藏方 法进行保藏。操作中，应避免交叉污染，减少菌株突变或发生典型特性变化。 注1： 制备的标准储备菌株为第2代菌株。 注2： 推荐采用超低温（-70） 或冻干的方法保藏。在较高温度下，应适当缩短贮存时间。 注3： 标准储存菌株不应用来制备标准菌株。 5.5 制备工作菌株 可同时挑取纯菌落转接斜面，于适当温度下培养适当时间，制成工作菌株
11、。需同时制备多份，并作 好标识，标识内容需包括菌株名称、菌株号、接种日期和所传代数等信息。 注1： 斜面上的工作菌株为第3代菌株，可在工作中使用。 注2： 可接种到TSA斜面、TSA血琼脂斜面或其他合适的培养基中，培养24小时。 注3： 工作菌株在合适的温度下（不同的微生物有不同的合适温度，有的为18-25，有的为2-8）可存放4周。 存放4周后，应转接下一代工作菌株。当工作菌株代数小于5时，可直接用上一代工作菌株转接下一代工作菌株。 注4 ：从标准菌株制备标准储备菌株/工作菌株的过程，可参考资料性附录B。 6 从标准储备菌株制备储备菌株/工作菌株 6.1 转种 取一支冷冻保存的标准储备菌株，
12、迅速解冻，制成菌悬液，转种于合适的非选择性平板上，于适当 温度下培养适当时间。 注1： 应根据菌种类型及其保存方式确定标准储备菌株转种时间，在规定的时间内转种。 注2: 通常采用5%的血琼脂、TSA或其他适合的固体培养基进行分离，以获得特性稳定的菌株。 注3： 转种在平板上的菌株为第3代菌株。 6.2 验证 对平板分离出的菌落，应进行纯度与形态验证，记录验证的结果并保存记录。 注： 也可以采取5.3的方式对菌株进行再次确认。 6.3 制备储备菌株 6.3.1 在验证的同时，挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液，分装于菌株保存容器中，需同时制备 多份。对每一支菌种保存容器进行适当标识，标识内容需包
13、括名称、菌种号、接种日期和所传代数等信 息。 DB51/T 21692016 4 注1： 若验证不合格，则将制备的储备菌株弃去。 注2： 若为需低温保存的菌株，在制备菌悬液时，应加入保护剂。例如采用-70低温冻存，可在TSB中添加10%-15% 的甘油作为冷冻保护剂。 6.3.2 根据菌株的特性，选择使用冻干保藏、利用多孔磁珠在-70冰箱、液氮罐或其他有效的保藏方 法进行保存。 注1： 制备的储备菌株为第3代菌株。 注2： 推荐采用超低温（-70） 或冻干的形式保藏。在较高温度下，应适当缩短贮存时间。 注3： 储备菌株不应用来制备标准储备菌株和标准菌株。 6.4 制备工作菌株 可同时挑取纯菌落
14、转接斜面，于适当温度下培养适当时间，制成工作菌种。需同时制备多份，并进 行适当标识，标识内容需包括名称、菌种号、接种日期和所传代数等信息。 注1： 斜面上的工作菌株为第4代菌株，可在工作中使用。 注2： 可接种到TSA斜面、TSA血琼脂斜面或其他合适的培养基中，培养24小时。 注3： 工作菌株在合适的温度下（不同的微生物有不同的合适温度，有的为18-25，有的为2-8）可存放4周。 存放4周后，应转接下一代工作菌株。当工作菌株代数小于5时，可直接用上一代工作菌株转接下一代工作菌株。 注4 ：从标准储备菌株制备储备菌株/工作菌株的过程，可参考资料性附录B 7 从储备菌株制备工作菌株 7.1 转种
15、 取一支冷冻保存的储备菌株，迅速解冻，制成菌悬液，转种于合适的非选择性平板上，于适当温度 下培养适当时间。 注1： 应根据菌种类别及其保存方式确定储备菌株存放时间。超过规定的时间，应予以销毁，除非标准方法中有明 确要求或实验室能够证明其相关特性没有改变。 注2: 通常采用5%的血琼脂、TSA或其他适合的固体培养基进行分离，以获得特性稳定的菌株。 注3： 转种在平板上的菌株为第4代菌株。 7.2 验证 验证使用平板分离菌落的纯度，记录验证的结果并保存记录。 注： 也可以采取5.3的方式对菌株进行再次确认。 7.3 制备工作菌株 同时挑取纯菌落转接斜面，于适当温度下培养适当时间，制成工作菌株，需同
16、时制备多份。并进行 标识，标识内容需包括名称、菌种号、接种日期和所传代数等信息。 注1： 斜面上的工作菌株为第5代菌株。 注2： 可接种到TSA斜面、TSA血琼脂斜面或其他合适的培养基中，培养24小时。 注3： 工作菌株在合适的温度下（不同的微生物有不同的合适温度，有的为18-25，有的为2-8）可存放4周。 超过4周，应予以销毁，除非标准方法中有明确要求或实验室能够证明其相关特性没有改变。 注4： 工作菌株不应用来制备储备菌株、标准储存菌株和标准菌株。 8 销毁 DB51/T 21692016 5 将以下菌株灭菌处理后丢弃： a) 拆开后的标准菌株、标准储备菌株、储备菌株以及传代培养次数大于
17、 5 次的工作菌株； b) 经确认或验证不合格的菌株； c) 超过保藏期限的菌株。 9 记录 菌株的保存与使用记录应予妥善保存，记录内容包括（但不限于）以下内容： a）从原始菌种（标准菌株）传代到工作用菌种的代数； b）菌种生长的培养基及孵育条件； c）菌种生存条件。 DB51/T 21692016 6 A A 附 录 A （资料性附录） 部分已获认可的标准菌株提供者名录 美国标准菌种收藏所（American Type Cultrure Collection，ATCC） 国立标准菌种收藏所(National Collec tion of Type Cultures，NCTC) 中国医学菌种保藏
18、管理中心（National Center fo r Medical Culture Collections，CM CC） 中国普通微生物菌株保藏管理 （China General Microbiological Cultrure Collection Center， CGMCC） 中国药学微生物菌种保藏管理中心（China Pharmaceu tical Culture Collection, CPCC)、 中国兽医微生物菌株保藏管理中心（China Veterina ry Culture Collection Center，CVCC ） 中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Cente
19、r o f Industrial Culture Collection, CICC) DB51/T 21692016 7 B B 附 录 B （资料性附录） 标准菌株制备流程图 B.1 由标准菌株（0 代）制备工作菌株和标准储存菌株 保存 获得标准菌株（ 0 代） 依据说明书要求复苏（ 1 代） 平板分离（ 2 代） 确认菌株的纯度和特性 符合 挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液 分装冻存或冻干 标准储存菌株（ 2 代） 挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（ 3 代） 挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（ 4 代） 工作菌株（ 5 代） 销毁 挑取纯菌落转种斜面并培养 否 是 DB51/T 2
20、1692016 8 B.2 由标准储存菌株（2 代）制备储备菌株和工作菌株 迅速解冻 标准储存菌株（ 2 代） 符合 挑取纯菌落用合适的培养基制成菌悬液 在非选择性平板上转种并培养 销毁 分装冻存或冻干 挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（ 5 代） 挑取纯菌落转种斜面并培养 在非选择性平板上转种并培养 验证菌株的纯度和形态（ 3 代） 验证菌株的纯度和形态（ 3 代） 符合 工作菌株（ 4 代） 否 否 是 是 迅速解冻 在非选择性平板上转种并培养 验证菌株的纯度和形态（ 4 代） 符合 挑取纯菌落转种斜面并培养 工作菌株（ 5 代） 储备菌株（ 3 代） 是 否 销毁 DB51/T 21692016 9 参 考 文 献 1 GB 4789.28 食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 2 SN/T 1538.1培养基制备指南实验室培养基制备质量保证通则 3 SN/T 1538.2培养基制备指南培养基性能测试实用指南 4 WS/T 232 商业性微生物培养基质量检验规程 _ DB51/T 21692016
