1、 ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 18342014 副猪嗜血杆菌 PCR 检测技术规范 2014 - 09 - 19 发布 2014 - 10 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 18342014 I 目 次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 设备和试剂 . . 1 5 DNA 提取. . 2 6 PCR 扩增. . 3 7 PCR 产物的电泳检测. . 3 8 结果判定 . . 3 9 废弃物处理 . . 3 附录 A（规范 性附录） 相关试剂配制 .
2、4 DB51/T 18342014 II 前 言 本标准的附录 A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：张斌、岳华、汤承、杨发龙、张焕容、任玉鹏、王远微。 DB51/T 18342014 1 副猪嗜血杆菌 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌的PCR检测方法。 本标准适用于副猪嗜血杆菌的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不住日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
3、 GB/T6682 分析实验室用水规格和实验方法。 GB/16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程。 兽医实验室生物安全技术管理规范（ 2003农业部公告第 302号）。 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 聚合酶链式反应（ PCR） 是一种分子生物学技术，用于体外大量扩增特定的 DNA 片段。 3.2 引物（ Primer） 是人工合成的两段寡核苷酸序列， 用于聚合酶链式反应， 其中一条引物与目标片段一端的一条 DNA 模板链互补，另一条引物与目标片段另一端的另一条 DNA 模板链互补。 3.3 副猪嗜血杆菌（ Haemophilus parasuis） 副猪嗜血杆
4、菌是猪上呼吸道的一种共栖菌，在特定的条件下侵入机体而引起严重的全身性疾病，以 纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征，又称为革拉泽氏病 (Glssers Disease)。该病已成 为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。 4 设备和试剂 4.1 主要仪器和设备 4.1.1 PCR 扩增仪 DB51/T 18342014 2 4.1.2 电泳仪、水平电泳槽 4.1.3 凝胶成像系统 4.1.4 冷冻高速离心机 4.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 4.1.6 高压灭菌锅 4.1.7 恒温水浴锅 4.1.8 移液器（0.1 L 2.5 L、0.1 L 1
5、0 L、2 L 20 L、20 L 200 L、200 L 1000 L） 4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10 mol/L） P1： 5-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3 P2： 5-GACTTCATCCTGCACTCTGT-3 引物扩增片段大小为 821 bp。 4.2.2 DNA 提取试剂：蛋白酶 K、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris 酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇 4.2.3 PCR 反应试剂： Taq DNA 聚合酶 （5 U/ L） 、 MgCl2（25 mmol/L） 、 dNTP（每种浓度为 2.5 mmol/L） 、 10 PCR Buffer（无 Mg2+）
6、4.2.4 STE 缓冲液（见附录 A） 4.2.5 TAE 电泳缓冲液（见附录 A） 4.2.6 6 上样缓冲液（6 Loading Buffer） 4.2.7 琼脂糖（电泳级） 4.2.8 核酸染料 (Goldview) 4.2.9 DL2000 bp DNA Marker。 4.2.10 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水（三蒸水）规格。 4.2.11 阳性对照：标准参考菌株作为阳性对照。 4.2.12 阴性对照：用 GB/T 6682 中三级水代替 PCR 扩增模板作为阴性对照。 5 DNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 组织样本：肺等组织样本，按 1 g 加入 1m
7、L 的 STE 缓冲液，剪碎并研磨，3000 r/min 进行离心 10 min，取上清液，12000 r/min 进行离心 20 min，弃上清，沉淀用于 DNA 提取。 5.1.2 胸腔渗出液：取 500 L 胸腔渗出液，加入 500 L STE 缓冲液，混匀，12000 r/min 离心 20 min， 弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。 5.1.3 液体培养物：500 L 液体培养物 12000 r/min 离心 20 min， 弃上清，收集沉淀用于 DNA 提取。 5.1.4 对照样本： 阴阳性对照样本处理与检测样本处理方法相同。 5.2 DNA 提取方法 5.2.1 向上述沉淀中
8、加入 500 L STE 缓冲液，使其震荡重悬。 5.2.2 加入 10%SDS 溶液 20 L，20 mg/mL 蛋白酶 K 10 L，混匀，在 56 C 水浴 60 min。 5.2.3 加入 530 L 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合液，混匀，1 2000 r/min 离心 5 min。 DB51/T 18342014 3 5.2.4 取200 L 上清液转移到另一离心管中，加入 200 L 氯仿/异戊醇（24:1）混合液，颠倒混匀， 12000 r/min 离心 5 min。 5.2.5 取上清，加入 2.5 倍体积的预冷无水乙醇，-20 C 沉淀 30 min，12000 r
9、/min 离心 5 min，弃去 上清液。 5.2.6 用 1 mL 70%乙醇漂洗，12000 r/min 离心 5 min，弃上清液。 5.2.7 室温干燥，DNA 沉淀用 25 L 无菌三蒸水溶解作为模板，-20 C 保存备用。 6 PCR 扩增 6.1 每次进行 PCR 扩增时，除检测样品外，均需设置阳性和阴性对照。 6.2 PCR 反应总反应体系 25 L，包括以下成份：10 PCR Buffer 2.5 L、MgCl2 (25 mmol/L) 2 L 、 dNTP (2.5 mmol/L) 2 L、TaqDNA 聚合酶(5 U/ L) 0.125 L、引物 P1 (10 mol/L
10、) 1 L、引物 P2 (10 mol/L) 1 L、水 14.375 L、模板 DNA 2 L。 6.3 PCR 反应条件为 95 C 预变性 5 min，然后进行 95 C 30 sec，55 C 30 sec，72 C 1 min 的循环， 进行 35 个循环，最后 72 C 延伸 10 min，4 C保存。 7 PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A） 。取 5 L PCR 产物与 1 L 6 上样缓冲液混 合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入 DNA 分子量标准（ DL2000） ，以 5 V/cm 恒压电泳，采用 凝胶成像系统判定核酸分
11、子大小。 8 结果判定 8.1 阳性对照出现一条 821 bp 大小的条带，且阴性对照样本不出现条带。 8.2 在满足 8.1 的条件下， 被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条 821 bp 的条带判定为核酸阳性 （+） ； 被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 821 bp 的条带判定为核酸阴性（-）。 9 废弃物处理 按 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理，废弃物实行无害化处理。 DB51/T 18342014 4 A A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂配制 A.1 STE缓冲液 0.1 mol/L NaCl 10 mmol/L Tris.HCl (pH 8.0) 1 mmol/L EDTA (pH 8.0) A.2 TAE电泳缓冲液 (pH 8.0) 50TAE 电泳缓冲液贮存液： Tris 碱 242 g EDTA 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 加双蒸水至 1000 mL，应用前用双蒸水将 50 TAE 电泳缓冲液进行 50 倍稀释。 A.3 2%的琼脂糖电泳凝胶板制备 琼脂糖 1 g 1TAE 电泳缓冲液 100 mL 将琼脂糖放入 TAE 电泳缓冲液中，加热融化，温度降至 60C 左右时加入 5 L 的核酸染料，混匀， 均匀倒板，厚度为 3 mm-5 mm。 _ DB51/T 18342014
