1、 ICS 65.020.40 B 61 DB51 四川省地方标准 DB51/T 19072014 板栗疫病菌分子检测技术规范 2014 - 11 - 11 发布 2014 - 12 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 19072014 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 原理 . . 2 5 试剂和设备 . . 2 6 结果判定 . . 5 7 结果表述 . . 5 8 检测过程 防止污染措施 . . 5 9 废弃物处理 . . 5 附录 A（资料性附录） 板栗疫病基因组 DN A PCR
2、 扩增结果 . 6 附录 B（资料性附录） PCR 产物序列 . . 7 DB51/T 19072014 II 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2 009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则的规定编写. 本标准由四川省林业厅提出并归口 本标准由四川省林业厅负责解释 本标准由四川省质量技术监督局批准 本标准起草单位：四川农业大学 本标准主要起草人：朱天辉、麻文建、李姝江、韩珊、谯天敏、张丽娜。 DB51/T 19072014 1 板栗疫病菌分子检测技术规范 1 范围 本标准规定了板栗疫病菌（ Cryphonectria parasitica）的 PCR 检测技术的一般原则和技术要求
3、。 本标准适用于四川省境板栗及山毛榉科植物枝干组织中板栗疫病菌的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6682-2008 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SN/T 1193 基因检测实验室技术要求 SN/T 2080-2008 栎树猝死病菌检疫鉴定方法 SN/T 2965-2011 植物病原真菌分子生物学检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 板栗疫病
4、 Chestnut blight 板栗疫病又名板栗胴枯病、腐烂病、干枯病等，是板栗栽培区的主要病害，主要危害主、侧枝及主 干的树皮，严重时造成整个枝条或全株死亡。 3.2 板栗疫病菌 Cyphonectria parasitic 板栗疫病菌学名为 Cyphonectria parasitic (Murr.) Barr。隶属子囊菌亚门 (Ascomycotina)，核菌纲 (Pyrenomycetes)，球壳菌目（ Sphaeriales） ，间座壳科（ Diaporthaceae）真菌。主要寄生于中国板栗、欧 洲板栗、锥栗、美洲板栗等山毛榉科植物。 3.3 聚合酶链式反应 polymerase
5、 chain reaction, PCR 用于放大扩增特定的 DNA 片段的反应。在一定的温度条件下，将模板 DNA 的双链解开成单链， 在 DNA 聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则，以 4 种 dNTP（ deoxyribonucleoside triphosphate, 脱 氧核苷酸三磷酸）为底物，利用退火使引物得以延伸，一般经过 30 个左右的循环， DNA 片段扩增倍数 就可达到 10 6 以上。 3.4 DB51/T 19072014 2 双重 PCR Duplex PCR 双重 PCR 是多重 PCR 的一种，指同一反应体系里加上两对引物，同时扩增两个核酸片段的反应。 3.5
6、扩增引物 primer 人工合成的寡核苷酸，与模板 DNA 的一段序列上碱基互补配对，在 PCR 扩增中起到引导 DNA 扩 增的作用。 3.6 扩增模板 template 用于 DNA 体外扩增的目标序列。 3.7 阳性对照 positive control 含有目的核酸序列的 DNA 片段，包括从已知含有目标序列的样品或含有目标序列的标准样品中所 提取的 DNA 序列。证明检测样品中含有目标序列。 3.8 阴性对照 negative control 不含有目标核酸序列的 DNA 片段，证明检测样品中不含有目标序列。 4 原理 提取板栗枝干组织样品或菌丝基因组 DNA 样品；以基因组 DNA
7、 为模板进行 PCR 扩增；经过琼脂 糖凝胶电泳，检测 PCR 扩增产物；对 PCR 扩增产物进行测序，将测序结果与参考序列比对，判断检测 样品中是否含有板栗疫病菌。 5 试剂和设备 除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB 6682-2008 的要求。 5.1 试剂 5.1.1 75 %酒精。 5.1.2 液氮。 5.1.3 三（羟甲基）氨基甲烷(Tris-HCl)。 5.1.4 氯化镁（MgCl2）。 5.1.5 盐酸HCl。 5.1.6 乙二胺四乙酸(EDTA)。 5.1.7 氢氧化钠（NaOH）。 5.1.8 氯化钾( KCl)。 5.1.9 三羟甲基氨基甲烷（Tr
8、is）。 5.1.10 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。 5.1.11 无水乙醇。 DB51/T 19072014 3 5.1.12 苯酚。 5.1.13 三氯甲烷。 5.1.14 异丙醇。 5.1.15 异戊醇。 5.1.16 蛋白酶 K。 5.1.17 TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA，pH=8.0。 5.1.18 10PCR Buffer: 100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl。 5.1.19 Taq DNA 聚合酶。 5.1.20 dNTP (三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸 dGTP、三磷酸腺嘌呤脱
9、氧核苷酸 dATP、三磷酸胸腺嘧啶脱氧 5.1.21 核苷酸 dTTP、三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸 dCTP)。 5.1.21 PCR 引物：PCR 引物信息见表 1。 表1 PCR 引物长度及扩增片段信息 引物名称 引物序列 碱基数（bp） 扩增片段大小 （bp） CP1 上游：5CGGCCCACTAAACTCTTTGT3 20 CP2 下游：5ATTTCAGGGCCTACCGTTTT3 20 285 SC1 上游：5AACGGTGACCCTTCTGGGGC3 20 SC2 下游：5AACGGTGACCGCAAAGGACTC3 21 389 5.1.22 DNA Marker：分子量标准品 DL
10、 1000 或DL 2000 bp （bp：base pair，碱基对）。 5.1.23 琼脂糖。 5.1.24 核酸染料（Golden View或类似产品）。 5.1.25 溴酚蓝 5.1.26 1TAE 电泳缓冲液：量取 50 TAE (242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5 mol/L Na2EDTA， 用盐酸或氢氧化钠调节 pH 至8.0，定容 1 L), 用蒸馏水稀释 50 倍。 5.2 仪器设备 5.2.1 PCR 仪。 5.2.2 高速离心机：最高转速不小于 12 000rpm。 5.2.3 微量移液器（0.5 L10 L，10 L100 L，100
11、L1000 L）。 5.2.4 冰箱(冷藏室4和冷冻室-20)。 5.2.5 超净工作台。 5.2.6 恒温水浴锅。 5.2.7 天平（感量 0.001 g）。 5.2.8 DNA 水平电泳仪。 5.2.9 凝胶成像分析系统。 5.2.10 灭菌枪头（2.5 L、10 L、20 L、100 L、1000 L）。 5.2.11 灭菌PCR 反应管0.2 mL。 5.2.12 离心管 2 mL。 5.2.13 超低温冰箱(-70)。 5.3 检测步骤 5.3.1 基因组 DNA 提取 DB51/T 19072014 4 将疑似板栗疫病症状的主干、枝条或分离出来的菌丝，按 CTAB 法提取 DNA。
12、其中，样本为植物组 织时，DNA 提取的一般步骤如下： （1）取 100 mg 左右样本，将表面用用 75 %酒精表面消毒后切成小块。 （2）用液氮研磨成粉末装入 2 mL 离心管中。 （2）加入 500 L 经过 60预热的 CTAB 缓冲液和0.1 g 蛋白酶 K，充分混匀，65水浴 60 min； 12 000rpm 离心 10 min，取上清。 （3）加入 700 L 体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） ，充分混匀，静置 10 min 后，12 000 rpm 离心 10 min，取上清。 （3）加入 500 L 三氯甲烷：异戊醇（24：1） ，混匀，12 000rpm 离心 10
13、 min，取上清。 （4）加入 1 mL 异丙醇充分混匀，-70放置 1 h。 （5）12 000 rpm 离心 20 min 弃上清液。 （6）用-20预冷的 70 %乙醇，充分洗涤后，置于超净工作台自然晾干至无酒精味。 （7）加入 50 L100 L1TE 溶液溶解后即得到 DNA 溶液，-20 保存。 样本为分离培养的菌丝时，质量应不少于 30 mg，基因组 DNA 提取方法见 SN/T 2965-2011，SN/T 2080-2008。 推荐使用基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA。 5.3.2 PCR 反应 PCR 扩增总体积为 25 L，将引物 CP1/CP2 和引物 SC
14、1/SC2 组合成双重 PCR 引物扩增 5.3.1 中所提 取基因组 DNA。PCR 反应体系各成分见表 2。 表2 PCR 反应体系 试剂 反应体系中加入量 10PCR Buffer（不含Mg2+） 2.5 L Taq DNA聚合酶（5 U/L） 0.2 L 引物CP1/CP2 溶液（各10 mol/L） 1.0 L/1.0 L 引物SC1/SC2 溶液（各10 mol/L） 1.0 L/1.0 L MgCl2溶液（25 mmol/L） 2.0 L dNTP溶液（2.5 mmol/L） 2.0 L DNA提取液 2.0 L 补灭菌双蒸水至 25 L 检测过程中应分别设阳性对照、阴性对照和空
15、白对照。用已确定含有板栗疫病菌的标准样本或菌丝 的菌丝基因组 DNA 做阳性对照模板，用健康样本做阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板 DNA 作空白对 照。 PCR 反应程序：94预变性 4 min；94变性 40 s，62退火30 s，72延伸 30 s，共35 个循环； 72延伸7 min。 5.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物 制备 1TAE 电泳缓冲液；用 1TAE 电泳缓冲液制备 2 %的琼脂糖凝胶（量取 100 mL1TAE 电泳 缓冲液，加 2 g 琼脂糖，沸腾 3 次后冷却至 60左右，加 5 L Golden View，混匀倒入制胶槽，制备 琼脂糖凝胶） ，吸取 8
16、L 的PCR 产物与 2 L 加样缓冲液（溴酚蓝混合） ，取5 L10 L（根据凝 胶孔大小）注入凝胶孔中，电压控制在 100 V 左右，电泳时间 30 min。电泳结束后在凝胶成像系统下 DB51/T 19072014 5 观察、拍照并记录。 6 结果判定 6.1 电泳检测结果 引物 CP1/CP2 扩增出条带位置在 300 bp 附近，参考附录 A 中泳道 3；引物SC1/SC2 扩增出的条带位 置在 400bp 附近，参考附录 A 中泳道 2。CP1/CP2 和 SC1/SC2 组成的双重 PCR 对板栗疫病菌扩增检测结 果参考附录 A 中泳道1。若阳性对照均未出现这两条带，则说明 DN
17、A 提取质量有问题或提取液中有抑制 PCR 的反应因子，应重新提取 DNA，直至能扩增出 300 bp 和400 bp 左右的双条带。 样品 PCR 扩增产物电泳后出现 400 bp 和 300 bp 左右的条带，同时板栗疫病菌阳性对照也同时扩增 出这两条带。阴性对照和空白对照的 PCR 扩增产物电泳后均没有出现目的片段；初步判定结果为阳性。 样品 PCR 扩增产物电泳后均未出现 400 bp 和 300 bp 左右的条带，阳性对照同时扩增出 400 bp 和 300 bp 左右的条带。阴性对照和空白对照的 PCR 扩增产物电泳后均没有出现目的片段；初步判定结果 为阴性。 6.2 PCR 产物
18、测序进一步确证 当 PCR 检测结果初步判定为阳性时，可以通过测序比对的方法进一步确证； 阳性样品 PCR 产物测序所得序列大小为 285 bp 和 389 bp，与参考序列比对的结果同源性在 95 % 以上，即判定检测结果为阳性。反之，则为阴性。参考序列见附录 B.1 和B.2。 7 结果表述 根据第 6 章的结果判定：PCR 检测结果为阳性，则结果表述为“组织样本中或菌丝中检测出板栗疫 病菌”；PCR检测结果为阴性，则表述为“组织样本中或菌丝中未检测出板栗疫病菌”。 8 检测过程防止污染措施 检测过程中出现的试剂污染、PCR 扩增产物污染、样品间交叉污染等问题，预防和解决措施见 SN/T
19、1193和GB/T 27403。 9 废弃物处理 检测过程中的产生的废弃物，收集后放到指定的地方集中销毁。 DB51/T 19072014 6 A A 附 录 A （资料性附录） 板栗疫病基因组 DNA PCR 扩增结果 注： 泳道M: DL2000marke r；泳道1：双引物（ CP1/CP2和SC1/SC 2）扩增结果；泳道2： SC1/SC2扩增结果；泳道3： CP1/CP2扩增结果；泳道4：阴性对照。 DB51/T 19072014 7 B B 附 录 B （资料性附录） PCR 产物序列 B.1 CP1/CP2 PCR扩增产物序列 (G enBank登录号：KJ73 7379) C
20、GGCCCACTAAACTCTTTGTTTTTATAACCTATCTCTTCTGAGTACATAAACCAAAAAAAATGAATCAAAACTTTC AACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAG TGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCTGGAATTCCAGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAC CCTCAAGCTTGGCTTGGTGTTGGGGTACTACCCGTAAAACGGTAGGCCCTGAAAT B.2 SC1/SC2
21、PCR扩增产物序列 (G enBank登录号：KJ72 9102) AACGGTGACCCTTCTGGGGCGCGTTTCAGGTGCAACCCACTCGGCCTCTCAATTCGACGATTCAACCTCTCGAC CTCTGGGCACCTTGGAAACACTTTGAGCCACCATGGGGGGAGGGGGGGGAACTGCAATGGTCCTCATGAGATCAGA GACGACCCTGTCTCGTTTCCCATTTTCCCCTCCTTTGGGATCTGCCCCGGCCTGGTGTTCCATCTCCAGTTGTTCCTTT TCTTCTTTCTTCTCCTCTTCGTAGGAACCCTGCCCTAAACTTGGCCATGAACTTCAAACAACAACAAACAATCTCATC CCACGCGGCCACCCTCTCGCCCGCTACTAATTTCTTTTCTCTCCAGCTGGTCTGAATACTCGAGTCCTTTGCGGTCAC CGTT 注：下划线部分为引物或其反向互补序列 _ DB51/T 19072014
