1、ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 18432014 猪 A 群轮状病毒 RT-PCR 检测技术规范 2014 - 09 - 19 发布 2014 - 10 - 01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 18432014 I 目 次 前 言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引用文件 . . 1 3 术语和定义 . . 1 4 设备和试剂 . . 1 5 RNA 提取. . 2 6 反转录 . . 3 7 PCR 扩增. . 3 8 PCR 产物的电泳检测. . 3 9 结果判定 . . 3 10 废弃物 无害化处理 . . 3
2、 附录 A（规范 性附录） 相关试剂的配制 . 5 DB51/T 18432014 II 前 言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：西南民族大学。 本标准主要起草人：任玉鹏、岳华、汤承、张斌、张焕容、杨发龙、王远微。 DB51/T 18432014 1 猪 A 群轮状病毒 RT-PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了猪 A 群轮状病毒 RT-PCR 检测方法。 本标准适用于猪只感染猪 A 群轮状病毒的检测、诊断和流行病学调查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，
3、仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 兽医实验室生物安全技术管理规范（ 2003农业部公告第 302号） 3 术语和定义 本标准采用下列术语和定义。 3.1 猪 A 群轮状病毒 group A porcine rotavirus，GAR 猪轮状病毒（ porcine rotavirus, PRV）是呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，基因组由 11个节段的双 股正链 RNA 组成； PRV 主要包括 A、 B、 E、 C 四个血清
4、型， 临床上猪只感染以猪 A群轮状病毒 （ group A porcine rotavirus, GAR）为主； 3.2 猪 A 群轮状病毒病 以猪 A 群轮状病毒为主要病原，引起剧烈呕吐、腹泻和脱水等为特征的人畜共患胃肠道传染病。 4 设备和试剂 4.1 主要仪器和设备 4.1.1 PCR 扩增仪 4.1.2 电泳仪、水平电泳槽 4.1.3 凝胶成像系统 4.1.4 冷冻高速离心机 4.1.5 微量高速离心机（适合于对 PCR 反应管进行离心操作） 4.1.6 高压蒸汽灭菌锅 4.1.7 涡旋仪 DB51/T 18432014 2 4.1.8 恒温水浴锅 4.1.9 移液器（0.1L2.5L
5、、0.1L10L、 20L200L、200L1000L） 4.2 主要试剂 4.2.1 引物（10mol/L） P1： 5-TCAAGCACGATTTGGAAC- 3 P2： 5 -GCCTGGTGGAAATACTGGTC- 3 扩增片段长度 274 bp。 4.2.2 变性液:见附录 A.1。 4.2.3 2 mol/L 醋酸钠溶液 (pH4.0)：见附录 A.2。 4.2.4 水饱和酚 (pH 4.0)。 4.2.5 氯仿/异戊醇 (49/1)混合溶液。 4.2.6 PrimescriptTM RT 试剂盒 4.2.7 Taq DNA 聚合酶 (5 U/L)。 4.2.8 1.0% 琼脂糖
6、凝胶：见附录 A.3。 4.2.9 50TAE 缓冲液：见附录 A.4。 4.2.10 核酸染料 (Goldview)。 4.2.11 DEPC 处理的灭菌双蒸水：见附录 A.5。 4.2.12 异丙醇。 4.2.13 DEPC 处理的灭菌双蒸水配置的 75%乙醇：见附录 A.6。 4.2.14 2.5 mmol dNTPs。 4.2.15 10PCR 缓冲液。 4.2.16 6 上样缓冲液（6 Loading Buffer）。 4.2.17 DNA 分子量标准 DL600。 4.2.18 水：所用水应符合 GB/T 6682 中三级水(三蒸水)规格。 4.2.19 阳性对照：猪 A 群轮状病
7、毒 CVCC AV69 株购自国家兽医微生物菌种保存中心。 4.2.20 阴性对照：用符合 GB/T 6682 中的三级水代替 RT-PCR 扩增模板。 5 RNA 提取 5.1 样本处理 5.1.1 肠内容物：选择疑似病症的猪只，无菌采集小肠内容物 1g，用 10 mmol/L PBS 缓冲液稀释 10 倍；在涡旋仪上振荡混匀后反复冻融 2 次，10000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。 5.1.2 肛门拭子：将肛门拭子等棉拭子浸入 1mL 的 10 mmol/L PBS 缓冲液中 30 min，充分混匀后反复 冻融 2 次，12000 r/m in 离心 10 min，取上
8、清液备用。 5.1.3 腹泻粪便：采集病猪新腹泻粪便 1g，用 10 mmol/L PBS 缓冲液将粪便稀释 10 倍，在涡旋仪上 振荡混匀后反复冻融 2 次，10000 r/mi n 离心 10 min，取上清液备用。 5.1.4 对照样本：阴阳性样本处理与检测样本处理方法相同。 5.2 异硫氰酸胍一步法抽提 RNA 5.2.1 每次试验前应设立阳性和阴性对照。 DB51/T 18432014 3 5.2.2 取处理后待检样品上清液 100 L，加入变性液 300 L 颠倒混匀，加入 30L 2 mol/L 乙 酸钠（pH 值 4.0）。反复颠倒离心管 5 次，在 25 的室温下放置 5 m
9、in。12000 r/min、4 离心 并取上清。 5.2.3 依次加入 150 L 饱和酚、150 L 氯仿-异戊醇，反复颠倒混匀 5 次，冰浴 15 min。 5.2.4 12000 r/min、4 离心 20 min，将上层含 RNA 的水相移入一新管中，不应吸取水相的最下层。 5.2.5 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴静置 10 min 沉淀 RNA。 5.2.6 12000 r/min、 4离心 10 min，弃上清。 5.2.7 加入 1 mL 用 DEPC 水配制的 75%乙醇颠倒混匀洗涤沉淀，120 00 r/min、4 离心 10 min，弃 上清。 5.2.8 将含有
10、RNA 沉淀的离心管静置干燥沉淀 5 min10 min，用 20 L DEPC 处理水将沉淀充分溶 解，在 -20 条件下保存备用。 6 反转录 6.1 cDNA 的合成：将溶解的 RNA 按照反转录试剂盒说明书反转录合成 cDNA。 6.2 cDNA 的合成体系为 10 L：5 PrimescriptTM Buffer 2.0 L，PrimescriptTM RT Enzyme Mix 0.5 L，Random 6 mers 1.0 L，RNA 2.0 L，Rnase Free H2O 4.5 L。混匀后放入 PCR 自动扩 增仪中进行反转录（RT）反应。 6.3 cDNA 的合成条件为：
11、37 15 min，85 5 s ，4 5 min。反转录后得到的 cDNA 置于 -20保 存。 7 PCR 扩增 7.1 PCR 反应体系：10PCR Buffer 2.5L、MgCl2（ 25 mM）2L、dNTP (2.5 mM) 2L、T aqDNA 聚合酶 (5 U/L) 0.125L、引物 P1 (10 mol /L) 1L、引物 P2 (10 mol/L) 1L、 ddH2O 14.375 L、模板 cDNA 2L，总体系 25L。 7.2 PCR 反应条件：94 预变性 5 min，94 30 s，51 30 s， 72 30 s 的循环，进行 35 个循 环，最后 72 延
12、伸 8 min，4 保存。 8 PCR 产物的电泳检测 8.1 用 TAE 电泳缓冲液配制成 2%琼脂糖凝胶（见附录 A）。 8.2 取 5 L PCR 产物与 1 L 6上样缓冲液混合，分别加入样品孔，同时在一加样孔中加入 DNA 分 子量标准（DL600），以 5 V/cm 恒压电泳，采用凝胶成像系统判定核酸片段大小。 9 结果判定 9.1 阳性对照出现一条 274 bp 大小的条带，且阴性对照样本不出现条带。 9.2 在满足 10.1 条件下，被检样品的 PCR 产物经电泳后出现一条约 274 bp 的条带判定为核酸阳性 （+）；被检样品的 PCR 产物经电泳后不出现 274bp 的条带
13、判定为核酸阴性（-）。 10 废弃物无害化处理 DB51/T 18432014 4 按 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程处理。废弃物实行无害化处理。 DB51/T 18432014 5 A A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 变性液 将 250g 异硫氰酸胍、 17.6 mL 0.75 mol/L（ pH7.0）柠檬酸钠和 26.4 mL 10%（ m/v）十二烷基肌酸 钠溶 293 mL 水中。 65 搅拌混匀，溶解充分。室温下保存，使用前按每 50 mL 变性液加 0.36 mL 14.4 mol/L -巯基乙醇。变性液可在室温下避光保存 6 个
14、月。 A.2 2 mol/L 乙酸钠溶液 (pH4.0) 在 100 mL 容量瓶中， 加入 16.4 g 乙酸钠， 加入适量灭菌双蒸水， 用冰乙酸调 pH 至 4.0 后定容。 A.3 2% 琼脂糖凝胶的配制 用琼脂糖 1.0 g， 1TAE 电泳缓冲液 100 mL， 混匀后在微波炉中完全融化， 待冷却至 50 60 时，加核酸染料 10 L，摇匀倒入凝胶板，待凝固后取下梳齿，备用。 A.4 50TAE电泳缓冲液 A.4.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液 (pH8.0) 在 100 mL 容量瓶中，加入 EDTA 18.61 g，加入适量灭菌双蒸水，用氢氧化钠调 pH 至 8.0 时定容。 A.4.2 TAE电泳缓冲液 (50) 配制 羟基甲基氨基甲烷 (Tris) 242 g、冰乙酸 57.1 mL、 0.5mol/L EDTA 溶液 (pH8.0) 100 mL，加灭菌 双蒸水至 1000 mL 充分混匀。用时用灭菌双蒸水稀释使用。 A.5 DEPC 水 DEPC 100 L，加超纯水至 100 mL，室温过夜， 121 高压 15 min，分装到 1.5 mL DEPC 处理 过的微量管中，冻存备用。 A.6 75% 乙醇 用 75 mL 无水乙醇，加 DEPC 水至 100 mL，混匀， 4 保存备用。 _ DB51/T 18432014
