1、ICS 11.220B 43重 庆 市 地 方 标 准DB50DB50/T 1006 2020牛 肺 炎 支 原 体 抗 体 检 测 方 法 Enzyme-linker immunosorbent assay For Mycoplasma bovis 2020-05-20 发 布 2020-08-20 实 施重 庆 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB50/T 1006 2020前 言本 标 准 按 GB/T 1.1-2009进 行 起 草 。本 标 准 由 重 庆 市 动 物 疫 病 预 防 控 制 中 心 提 出 。本 标 准 由 重 庆 市 农 业 农 村 委 员 会 归 口 。
2、本 标 准 起 草 人 :蔺 露 、 曾 政 、 姚 璐 、 董 春 霞 、 孙 燕 、 谢 建 华 、 陈 忠 琼 、 凌 洪 权 、 梁 望 旺 、 杨 泽 林 、程 千 川 。 DB50/T 1006 2020 1 牛 肺 炎 支 原 体 抗 体 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 牛 肺 炎 支 原 体 抗 体 检 测 方 法 ， 利 用 牛 肺 炎 支 原 体 抗 体 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 ， 检 测 牛 肺 炎支 原 体 抗 体 。本 方 法 适 用 于 检 测 牛 血 清 （ 血 浆 ） 的 牛 肺 炎 支 原 体 抗 体 。2 规 范 性 引 用 文 件下
3、 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 ， 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB/T1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 牛 肺 炎 支 原 体是 指 引 起 牛 传 染 性 支 原 体 肺 炎 （ 又 称 烂 肺 病 ）
4、以 肺 部 病 变 为 主 要 特 征 的 传 染 病 的 一 种 支 原 体 。3.2 酶 联 免 疫 吸 附 试 验简 称 酶 联 免 疫 法 ， 或 者 ELISA法 。 将 已 知 的 抗 原 或 抗 体 吸 附 在 固 相 载 体 ( 聚 苯 乙 烯 微 量 反 应 板 ) 表面 ， 使 酶 标 记 的 抗 原 抗 体 反 应 在 固 相 表 面 进 行 ， 用 洗 涤 法 将 液 相 中 的 游 离 成 分 洗 除 ， 抗 体 与 酶 复 合 物 结合 ， 然 后 通 过 显 色 来 检 测 。 4 牛 肺 炎 支 原 体 P39抗 原 酶 联 免 疫 吸 附 试 验4.1 试 验
5、 材 料洗 液 ： 配 制 见 附 录 第 A.1章 ； 稀 释 液 ： 配 制 见 附 录 第 A.2章 ； 标 准 阳 性 血 清 ： 含 牛 肺 炎 支 原 体 抗 体 的牛 血 清 ； 标 准 阴 性 血 清 ： 无 牛 肺 炎 支 原 体 抗 体 的 牛 血 清 ； 酶 结 合 物 ： 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ HRP） 标 记 的 羊抗 牛 IgG； 底 物 溶 液 ： 配 制 参 见 附 录 第 A.3-A.4章 ； 终 止 液 ： 配 制 参 见 附 录 第 A.5章 。4.2 操 作 步 骤4.2.1 样 品 准 备将 被 检 血 清 （ 或 血 浆 ） 用 稀 释 液
6、 （ 见 附 录 A.2） 做 1:40稀 释 。4.2.2 加 样 取 出 抗 原 包 被 板 ， A1、 B1加 入 100 L阴 性 对 照 ， C1、 D1加 入 100 L阳 性 对 照 ， 其 余 孔 加 入 1:40稀 释的 被 检 血 清 （ 血 浆 ） ， 每 孔 100 L， 将 加 样 位 置 做 好 记 录 ， 用 封 膜 封 板 ， 室 温 孵 育 30min。4.2.3 洗 涤 DB50/T 1006 2020 2 吸 除 孔 内 液 体 ， 每 孔 加 300 L冲 洗 液 （ 见 附 录 A.1） 冲 洗 ， 重 复 5次 ， 在 吸 水 纸 上 轻 拍 ， 确
7、 保 孔 内 无残 留 液 体 。4.2.4 加 酶 标 抗 体每 孔 加 入 酶 标 抗 体 液 100 L， 以 封 膜 封 板 ， 室 温 孵 育 30min。4.2.5 洗 涤洗 涤 方 法 同 4.2.3。4.2.6 加 底 物每 孔 加 入 100 L底 物 使 用 液 （ 见 附 录 A.3和 附 录 A.4） ， 室 温 孵 育 10min。4.2.7 终 止加 终 止 液 （ 见 附 录 A.5） ， 100 L/孔 ， 使 其 终 止 反 应 。 4.3 结 果 判 定设 定 酶 标 仪 检 定 波 长 在 450nm（ 即 OD值 ） ； 阳 性 对 照 均 值 （ PC
8、） 0.5， 阳 性 对 照 OD值 的 均 值 （ PC）与 阴 性 对 照 均 值 （ NC） 的 比 值 4， 判 定 实 验 有 效 ， 若 两 者 不 成 立 ， 则 实 验 无 效 ， 需 重 复 ； 待 测 样 本 的判 定 ， S/P值 0.4者 判 定 为 阳 性 ， S/P值 0.4为 阴 性 样 本 。S/P= NCPC NCS 其 中 S为 待 测 样 本 的 OD值 。 DB50/T 1006 2020 3 附 录 A试 剂 的 配 制A.1 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ 含 0.05%Tween-20 的 0.01mol/L pH7.4 的 PBS， 即 PBST）P
9、BS氯 化 钠 8g磷 酸 二 氢 钠 0.2g磷 酸 氢 二 钠 2.9g氯 化 钾 0.2g蒸 馏 水 加 至 1000mLPBST Tweent-20 0.5mL加 0.01mol/LpH7.4 的 PBS 至 100mLA.2 稀 释 液 （ 含 0.1%BSA 的 PBST）牛 血 清 白 蛋 白 (BSA) 0.1g加 PBST 至 100mL4 存 放 ， 避 光 。A.3 底 物 缓 冲 液柠 檬 酸 0.47g十 二 水 合 磷 酸 氢 二 钠 1.84g蒸 馏 水 加 至 100mL， pH 值 5.0-5.4 A.4 底 物 使 用 液TMB(2mg/mL ) 0.5mL底 物 缓 冲 液 （ pH5.5） 9.5mL0.75%H2O2 42 LA.5 终 止 液浓 硫 酸 11.1mL蒸 馏 水 88.9mL
