1、ICS 65.020 B 16 DB46 备案号：33827-2012 海南省地方标准 DB 46/ T 2202012 槟榔苗黄化病植原体 PCR 检测技术规范 Technical specification for PCR detection of arecanut yellow leaf phytoplasma of seedling 2012 - 04 - 18 发布 2012 - 05 - 18 实施 海南省质量技术监督局 发布 DB46/ T 2202012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由
2、海南省质量技术监督局提出。 本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。 本标准主要起草人：罗大全、车海彦、温衍生、徐雪莲。 本标准首次发布于2012年4月。 DB46/ T 2202012 1 槟榔苗黄化病植原体 PCR 检测技术规范 1 范围 本标准规定了槟榔苗黄化病植原体的检测技术规范。 本标准适用于槟榔苗中槟榔黄化病植原体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3
3、术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 Ct 值 指荧光信号有统计意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数。 3.2 槟榔苗 用成熟种果育成的实生苗，育苗时间在两年以内的苗。 4 原理 以染色体DNA 为基础的分子生物学技术已用来检测和鉴定植原体。根据16S rRNA 基因保守序列设 计通用引物，应用巢式PCR （nested PCR ）技术检测。根据16S rRNA 基因序列设计翠菊黄化组（16Sr 组）植原体特异性引物/ 探针组合，进行实时荧光PCR 的检测。 5 仪器设备 台式高速冷冻离心机（最高转速在12000 rpm以上）、 全自动 数码 凝胶图像分析系统 、PCR仪、 全
4、自动荧光定量PCR系统 、全自动灭菌器、电子分析天平（万分之一）、旋涡混合器、水平电泳装置， 微量可调移液器（0.1-1000 L)。 6 试剂和缓冲液配制 DB46/ T 2202012 2 用于巢式PCR和实时荧光PCR检测的试剂和缓冲液配制，参见附录A。 7 检测方法 7.1 槟榔心叶总 DNA 提取 称取抽样的槟榔植株刚抽出的心叶0.5 g，加入适量液氮研磨呈粉状，再加入1 mL DNA 提取缓冲液 充分研磨，然后加入80 L 10% 十二烷基肌氨酸钠，混匀，在55温育12 h， 4 6000 rpm 离心 10 min， 取上清液；加入2/3体积异丙醇到上清液中，轻轻混匀， -20保
5、持至少30 min ， 4 8000 rpm 离心15 min ， 弃上清；加入600 L TE 缓冲液、30 L 10% 十二烷基硫酸钠和12 L 蛋白酶K （5mg/ml ），轻轻彻底悬 浮沉淀， 37温育30-60 min ；加 100 L 5M NaCl混匀，再加入84 L CTAB/NaCl 溶液混匀， 65温育10 min；加入等体积氯仿：异戊醇（24 ：1 ）混匀， 4 6000 rpm 离心5 min ，重复直至无中间白色层；取 上清液，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25 ：24： 1），混匀，4 6000 rpm 离心5 min；取上清液， 加入2/3体积异丙醇，混匀， -2
6、0保持至少30 min ， 4 12000 rpm 离心10 min ，弃上清液；加入500 L 70% 乙醇洗涤， 4 12000 rpm 离心10 min ，洗涤两次；取沉淀，加入50 L TE 混匀溶解。加入5 L RNaseA(10 g/l)，37 30 min, 除去 RNA。 7.2 巢式 PCR 检测 下述反应均需同时设植原体16S rDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对 照，设灭菌双蒸水作为空白对照。 7.2.1 引物序列 引物采用植原体16S rDNA通用引物R16mF 2/R16mR1和R16F2n /R16R2，引物序列见表1。 表1 巢式 PCR
7、 检测的引物序列 引物名称 引物序列 5-3 R16mF2 CATGCAAGTCGAACGGA R16mR1 CTTAACCCCAATCATCGAC R16F2n ACGACTGCTAAGACTGG R16R2 GCGGTGTGTACAAACCCCG 7.2.2 PCR 反应 PCR反应体系见表2。 PCR反应条件为：94，预变性2 min；94变性1 min；45退火45s，72延伸1 min；共进行30 个循环，最后72延伸10 min。 以R16mF2/R16mR1作为第一引物对，R16F2n/ R16R2 作为第二引物对，进行巢式PCR ( nested - PCR) 扩增，直接PCR
8、以7.1中提取的总DNA为模板，巢式PCR以直接PCR产物稀释50倍后的样品为模板。PCR反应 体系和反应条件与直接PCR扩增相同。 表2 巢式 PCR 反应体系 组分 加样量（ L） 10PCR buffer 2.0 25 mmol/L MgCl2 2.5 DB46/ T 2202012 3 表2（续） 组分 加样量（ L） 10 mmol/L dNTPs 2.5 10 mol/L 上游引物 1.0 10 mol/L 下游引物 1.0 Taq DNA 聚合酶（5U/ L） 0.2 模板 DNA 1.0 补灭菌双蒸水至最终反应体系 25 L 取5 L PCR产物在1琼脂糖凝胶（含0.5 g/
9、mL溴化乙锭）中电泳。利用Marker DL2000作为分子 量标准，在120V电场强度下电泳约20 min，最后用 全自动数码凝胶图像分析系统 照相。 7.2.3 PCR 产物序列 RFLP 图谱分析 将第二轮PCR 产物进行序列测定，序列结果利用植原体分类鉴定的在线专用数据库 -iPhyClassifier （ http:/plantpathology.ba.ars. usda. gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi）进行 RFLP图谱分析。 7.2.4 结果判定 巢式PCR检测结果判定见表3。 表3 巢式 PCR 检测结果判定简表 判定条件 第二轮
10、 PCR 产物在 1.2 kb 处是否有条带出现（见图 B.1） 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品 检测样品序列的 RFLP 图 谱分析结果与槟榔黄化病 植原体标准图谱（见图 B.2）是否一致 结果判定 否 否 是 是 是 检测样品含黄化病植原体 否 否 是 是 否 否 否 是 否 - 检测样品不含黄化病植原 体 否 否 否 - - 否 是 - - - 是 - - - - 检测结果无效，重新进行 巢式 PCR 检测。 7.3 实时荧光 PCR 检测 下述反应均需同时设植原体16S rDNA质粒作为阳性对照，设经确认的健康槟榔植株叶片作为阴性对 照，设灭菌双蒸水作为为空白对照。 7.3.1
11、 槟榔黄化病植原体引物/探针 引物和探针序列见表4。 DB46/ T 2202012 4 表4 实时荧光 PCR 检测用引物/探针序列 引物/探针名称 引物/探针序列 5-3 PbLF GCGAAGGCGGCTTGCT PbLR TTTGCTCCCCACGCTTTC bFprobe FAM-CTTTACTGACGCTGAGGCA-MGBNFQ（FAM 指荧光报告基团， MGB 指小沟结合物，NFQ 指非荧光淬灭基团） 7.3.2 实时荧光 PCR 反应体系、反应条件 实时荧光 PCR 反应体系见表 5。 表5 实时荧光 PCR 的反应体系 组 分 终浓度或体积 TaqMan R Univers
12、al RCR Master Mix 12.5 L 上游引物 PbLF 650 nM 下游引物 PbLR 650 nM 荧光探针 bFprobe 230 nM 模板 DNA 1 L 补灭菌双蒸水至最终反应体系 25 L 实时荧光 PCR 反应条件： 50 2 min；95 10 min；94 15 s，60 1 min ，40 个循环。 7.3.3 实时荧光 PCR 检测结果的判定 实时荧光 PCR 检测结果的判定见表 6。 表6 实时荧光 PCR 检测结果的判定简表 判定条件 荧光信号是否有增加（见图 B.3） 空白对照 阴性对照 阳性对照 检测样品 检测样品的 Ct 值 是否小于等于 35
13、结果判定 否 否 是 是 是 检测样品含黄化病植原体。 否 否 是 是 否 重新进行检测，若 Ct 值仍介于 35 和 40 之间，检测样品含黄化病植 原体。 否 否 是 否 - 检测样品不含黄化病植原体。 否 否 否 - - 否 是 - - - 是 - - - - 检测结果无效，重新进行实时荧 光 PCR 检测。 DB46/ T 2202012 5 AA 附 录 A （规范性附录） 巢式 PCR 和实时荧光 PCR 检测试剂和缓冲液配制 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂。实验室用水均为去离子水，按GB/T 6682-2008的有关 规定。 A.1 化学试剂 十六烷基三甲基溴化铵、三羟基
14、氨基甲烷、十二烷基肌氨酸钠、二水乙二胺四乙酸二钠、苯酚、氯 仿、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭。 A.2 分子生物学试剂 Taq DNA聚合酶、 10PCR缓冲液、 dNTP液（2.5 mmol/L dATP,dTTP, dCTP, dGTP) 、 TaqMan R Universal RCR Master Mix、DNA 分子量标记。 A.3 缓冲液 A.3.1 1M Tris-HCl（Ph8.0） 称量121.1 gTris置于1 L烧杯中，加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，用盐酸调节PH值至8.0， 将溶液定容至1 L,高温高压灭菌后，室温保存。 A.3.2
15、0.5 M EDTA 称取186.1 g Na 2EDTA2H 2 O，置于1 L 烧杯中，加入约800 ml 的去离子水，充分搅拌，用NaOH调节 PH值至8.0，加去离子水将溶液定容至1 L，高温高压灭菌后，室温保存。 A.3.3 DNA抽提缓冲液 量取 1 M Tris-HCl（pH 8.0 ） 10 ml， 0.5 M EDTA 20 ml，置于 100 ml 烧杯中，充分混匀，再加入 1.461g NaCl，充分搅拌，用去离子水将溶液定容至 100 ml，高温高压灭菌后，室温保存。使用前每毫升提取 缓冲液中加入 100 g 蛋白酶 K。 A.3.4 CTAB/NaCl溶液 称取 4.
16、1 g NaCl 置于 100 ml 烧杯中，加入约 80 ml 的去离子水，充分搅拌，然后缓慢加入 10 g CTAB， 同时加热并搅拌，用去离子水将溶液定容至 100 ml，高温高压灭菌，室温保存。 A.3.5 TE缓冲液(pH8.0) 量取 1 M TrisCl（pH8.0） 1ml 和 0.5 M EDTA（pH8.0） 200 l 依次加入 100ml 烧杯中，向烧杯中加 入约 80 ml 的去离子水，均匀混合，将溶液定容至 100 ml 后，高温高压灭菌，室温保存。 A.3.6 TAE电泳缓冲液（50） （pH约8.5） DB46/ T 2202012 6 称取Tris 242 g
17、 和Na 2 EDTA2H 2 O 37.2 g置于 1 L烧杯中，向烧杯中加入约 800 ml的去离子水，充分 搅拌溶解，再向烧杯中加入 57.1 ml的CH 3 COOH，充分搅拌，加去离子水将溶液定容至 1L，室温保存。 DB46/ T 2202012 7 BB 附 录 B （资料性附录） 槟榔黄化病植原体巢式 PCR 电泳图、16S rDNA 序列指纹图谱和实时荧光 PCR 检测图 B.1 槟榔黄化病植原体巢式PCR电泳图 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 图B.1 槟榔黄化病植原体巢式 PCR 电泳图 B.2 槟榔黄化病植原体核糖体 16S rDNA序列指纹图谱 118 bp 72 bp 281bp 234 bp 271bp 194 bp 310 bp 1078 bp 1353 bp 603 bp 872 bp 图B.2 槟榔黄化病植原体核糖体 16S rDNA 序列指纹图谱 B.3 槟榔黄化病植原体实时荧光PCR检测 图 DB46/ T 2202012 8 图B.3 槟榔黄化病植原体实时荧光 PCR 检测结果（ABI 公司 7500 型全自动荧光定量 PCR 系统） C _
