1、ICS 65. 150 B50 DB46 海南省 地 方 标 准 DB 46/ T 280 2014 罗非鱼链球菌病检测技术规程 The detection technical regulations for Streptococcosis in Tilapia 2014 - 02 - 13 发布 2014 - 03 - 01 实施 海南省质量技术监督局 发布 DB46/ T 2802014 I 前 言 本标准按 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由海南省海洋与渔业厅提出 并归口 。 本标准起 草单位：海南省 海洋与渔业科学院 、中国水产科学研究院珠江水产研究所。 本标准主要起
2、草人：王德强、可小丽、刘志刚、佟延南、李芳远、卢迈新、高风英、朱华平。 DB46/ T 2802014 1 罗非鱼链球菌病检测技术规程 1 范围 本标准 规定 了罗非鱼链球菌病病原体与流行情况、检测链球菌所用试剂、染色液和培养基、仪器设 备、采样、临床诊断、实验室诊断、细菌致病性实验 和 结果判定 等 方法 。 本标准适用于罗非鱼链球菌病的检测与诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本文件。凡是不注日 期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验
3、 染色法、培养基和试剂 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第 1部分：通用技术 3 病原体与流行情 况 3.1 主要病原体 无乳链球菌（ Streptococcus agalactiae） 、海豚链球菌（ Streptococcus iniae）。 3.2 流行情况 在我国南方罗非鱼养殖区，一年四季均有 发生 ，水温 30 以上为爆发高峰期，对各种规格罗非鱼均 可造成危害。 4 试剂、 染色液和培养基 除非另有说明，检测中所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。实验中所需常规试剂、染色 液和培养基均按 SC/T 7201.1 和附录
4、 A的规定执行，其他分子生物学试验试剂按附录 B的规定执行。 5 仪器设备 除下列仪器设备外，其余 仪器设备按 SC/T 7201.1 的规定执行。 a) PCR 扩增仪。 b) 核酸电泳仪和水平电泳槽。 c) 凝胶成像仪。 d) 微量移液器。 6 采样 DB46/ T 2802014 2 病鱼样品采集按 SC/T 7014的规定执行。 7 临床诊断 7.1 活动情况 患病鱼活动缓慢，反应迟钝，食欲减退，离群独游；病情严重时， 常在水面翻滚或打转 。 7.2 外部检查 体色发黑，眼球肿大突出，眼角膜发白浑浊，虹膜充血，严重 者 眼球脱落；下颌、鳃盖边缘、鳍条 基部不同程度的充血、出血，伴有肛门
5、红肿、外突的现象； 部分急性患病个体 有时无 上述症状 。 7.3 解剖检查 肝脏充血、肿大，颜色不均，呈花肝状，质地脆弱；脾充血肿大；胆囊充盈、充满蓝黑色的胆汁； 部分患病鱼体 出现 腹水，肠道有轻度炎症，肠腔内有少量黄色的粘液。 8 实验室诊断 8.1 病原菌分离 8.1.1 平板划线分离 以无菌操作 分别从病鱼眼、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织中 取 少量组织划线接种于血琼脂平板， 28 倒置培养 2448 h。 8.1.2 纯培养 用无菌 接种环挑取单个菌落，接种于新的血琼脂平板上， 28 倒置培养 24 h。 8.2 菌落形态 在血平板上培养 24 h后，无乳链球菌菌落圆形，直径 1 mm
6、 2 mm， 呈乳白色、不透明，菌落表面湿 润光滑、微隆起、边缘整齐；海豚链球菌菌落圆形，直径 1.5 mm 3 mm, 呈灰白色、不透明，表 面 光滑、 湿润。 8.3 革兰氏染色 按 GB/T 4789.28 执行 。 无乳链球菌革兰氏染色呈阳性，菌体为球形或卵形，无鞭毛，无芽孢，菌体呈 单个、成对或 长链状 排列。海豚链球菌革兰氏染色呈阳性，球形，单个或 成对排列 ，少数 3 4个排成短链状 ，无鞭毛， 无 芽 孢。 8.4 生理生化检验 8.4.1 常规检测方法 8.4.1.1 运动性试验 DB46/ T 2802014 3 用灭菌牙签或接种针将纯培养的细菌穿刺 垂直接种于半固体 BH
7、I培养基中央 ， 28 培养 24 h。通过 细菌由中央向周边迁移形成游动圈大小来检测 其 运动性强弱。 再 用 0.85 %生理盐水将细菌制成 轻度混浊的 菌悬液 （约 1106 CFU/mL)，滴于载玻片上，盖上盖玻 片，显微镜观察 其 运动情况。 8.4.1.2 生长试验 将细菌接种于血平板， 于 10 和 45 培养过夜 ，观察其 是否生长； 再 将细菌分别接种于 6.5 % NaCl、 pH 9.6的 BHI液体培养基和添加 0.1%美蓝牛 奶 BHI液体培养基中， 37 孵育 48 h，观察其生长情 况。 8.4.1.3 溶血试验 用无菌接种环将细菌接种于新鲜的的血琼脂平板上， 2
8、8 倒置培养 24 h。在血平板上形成明 显的透明环为 溶血，形成狭窄的灰绿色溶血环为 溶血， 不形成 溶血环为 溶血。 8.4.1.4 马尿酸钠水解试验 用无菌接种环将待检菌接种于 1 mL含 1 %马尿酸钠的 BHI液体培养基中， 37 孵育 48 h， 1500 g离 心 3min，取上清液 0.8 mL，加入三氯化铁试剂 0.2 mL，立即混匀， 10 min 15 min后 观察结果；出现恒 定沉淀物为阳性。 8.4.1.5 接触 酶试验 按 SC/T 7014规定执行。 8.4.1.6 淀粉水解试验 按 SC/T 7014规定执行。 8.4.1.7 吲哚试验 按 SC/T 7014
9、规定执行。 8.4.1.8 V-P 试验 按 SC/T 7014规定执行。 8.4.1.9 糖类分解试验 按 SC/T 7014规定执行。 8.4.1.10 试剂盒检测方法 8.4.1.10.1 API 20 STREP 检测 8.4.1.10.1.1 革兰氏染色 按 GB/T 4789.28 执行 。 8.4.1.10.1.2 接触酶试验 按 8.4.1.5的规定执行。 DB46/ T 2802014 4 8.4.1.10.1.3 溶血试验 按 8.4.1.3的规定执行。 8.4.1.10.1.4 生化指标检测 按 API 20 STREP试剂盒说明书进行。 8.4.1.10.1.5 结果判
10、读 根据试剂盒说明书的判读表 判读 。 8.4.1.10.2 Rapid ID 32 STREP 检测 8.4.1.10.2.1 革兰氏染色 按 GB/T 4789.28 执行 。 8.4.1.10.2.2 接触酶试验 按 8.4.1.4的规定执行。 8.4.1.10.2.3 溶血试验 按 8.4.1.3的规定执行。 8.4.1.10.2.4 生化指标检测 按 Rapid ID 32 STREP试剂盒说明书执行。 8.4.1.10.2.5 结果判读 用 ATB TM Expression仪或 mini API或人工判读。 8.5 聚合酶链式反应（ PCR）检测 8.5.1 细菌 16S rRN
11、A 基因序列检测 8.5.1.1 样品处理 取细菌纯培养液 2 mL 置于离心管中， 12000 rpm离心 10 min，收集菌体，用 1 mL TE缓冲液 (pH 8.0) 重悬菌体；加入 50 mg/mL溶菌酶溶液 6L， 37 水浴 2 h；再加入 2 mol/L NaCl 50 L， 10% SDS 110 L， 20 mg/mL蛋白酶 K 3 L， 37 水浴过夜。 8.5.1.2 细菌基因组 DNA 提取 细菌 DNA抽提按照 SC/T 7014中 8.2.7.2的规定进行。 8.5.1.3 PCR 扩增 16S rRNA 基因片段 8.5.1.3.1 PCR 反应体系 10PC
12、R buffer (含 Mg2+) 5 L， 10 mmol/L dNTP 1 L， 5 U/L Taq酶 0.5 L，引物 PLS和 PLA (20 mol/L) 各 1L， DNA模板 2 L，用无菌双蒸水补至 50 L。 8.5.1.3.2 PCR 反应程序 DB46/ T 2802014 5 94 预变性 5 min； 94 变性 30 s， 57 退火 30 s， 72 延伸 2 min，循环 30次； 72 再延伸 10 min。 8.5.1.4 电泳检测及胶回收 PCR产物经 1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测，预期扩增片段大小为 1471 bp。切胶回收并纯化目的条带。 8.5.1
13、.5 克隆测序 参照试剂盒说明书 的操作 步骤将纯化的目的片段连接于 pMD18-T克隆载体，转化 DH5感受态细胞， 通过蓝白斑筛选挑取阳性克隆进行 PCR检测，并进行测序分析。 8.5.1.6 测序 结果分析 采用序列拼接软件 ContigExpress对测序结果进行拼接，采用 Vector NTI suite 8.0软件和 BLAST 程序 (http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列同源性分析。分离菌株与 GeneBank中已登录的 无乳链球菌或海豚链球菌 16S rRNA基因序列同源性为 99 %以上。 8.5.2 双重 PCR 快速鉴别无乳链球菌
14、和海豚链球菌 8.5.2.1 双重 PCR 反应体系 10L 2GC-rich buffer (含 Mg2+)， dNTP 0.4 L(10mmol)，两对引物 (P1和 P2； P3和 P4) 各 0.5 L(20 mol/L)， DNA模板 2 L， 5 U/L Ex Taq酶 0.2 L，加无菌 双蒸水 至 20 L。 8.5.2.2 双重 PCR 反应程序 96 预变性 5 min； 94 变性 45 s， 51 退火 30 s， 72 延伸 35 s，循环 32次； 72 再延伸 10 min。 8.5.2.3 电泳检测 阳性对照 (模板为无乳链球菌和海豚链球菌 DNA混合物 ) 的
15、 PCR产物经 1.0 %的琼脂糖凝胶电泳结果 应同时显 474 bp和 296 bp两条带，阴性对照 (无 DNA模板 ) 的 PCR产物电泳结果 不显示任何条带，则认定 检测结果成立，否则检测结果不成立。 在实验结果成立条件下，若扩增产物为 474 bp的唯一条带，菌株为无乳链球菌；若扩增产物为 296 bp 的唯一条带，菌株为海豚链球菌。 9 细菌致病性实验 9.1 感染对象和条件 应选择与被检样品同龄、同规格 、同品种（系）无患病史 的健康罗非鱼； 感染 水温 与 原始发病水温 一致 。 9.2 感染方式 用无菌生理盐水或蒸馏水稀释菌落，制成菌悬液，通过注射 （ 肌肉或腹腔 注射 ）
16、或 浸泡方式对鱼体 进行人工感染， 连续 7 d 观察实验鱼的反应。 9.3 感染结果 根据科赫法则，人工感染患病的罗非鱼出现与自 然患病罗非鱼相同的症状，且从人工感染患病的罗 非鱼中分离出与人工感染细菌菌落形态相同的细菌，可确定为病原菌 。 DB46/ T 2802014 6 10 结果判定 符合以下所有特征性者可判定为链球菌病： a) 临床检验结果符合 7 中规定。 b) 菌落形态符合 8.2 的规定，革兰氏染色结果符合 8.3 规定。 c) 生理生化检测结果符合附录 C 中规定。 d) 或 API 20 STREP 或 Rapid ID 32 STREP 试剂盒的检测结果为无乳链球菌。
17、e) 或细菌 16S rRNA 基因 序列同源性分析结果符合 8.5.1.6 规定。 f) 或双重 PCR 结果符合 8.5.2.3 规定。 g) 致病性实验结果符合 9.3 规 定。 DB46/ T 2802014 7 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制方法 A.1 1TAE Buffer (pH 8.5) Tris碱 242 g， Na2EDTA.H2O 37.2 g，加约 800 mL去离子水，充分搅拌溶解，加入冰乙酸 57.1 mL， 充分搅拌后加去离子水定容至 1000 mL，使用时 50倍稀释。 A.2 TE Buffer (Ph 8.0)： 1 mol/L Tirs-HCl
18、(pH 8.0) 100 mL， 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 20 mL，混合后加去离子水定容至 1 L，高温 高压灭菌，室温保存。 A.3 10PCR Buffer (Mg2+ Plus)： 100 mmol/L KCl， 160 mmol/L ( NH4)2SO4， 20 mmol/L MgS04， 200 mmol/L Tris-HCl (pH8.8)， 1% Triton X-100， l mg/mL BSA。 A.4 BHI（脑心浸出液 Brain Heart Infusion， BHI）液体培养基 A.4.1 配方 幼牛脑（提取浸出粉） 200 g 牛心（提取浸出
19、粉） 250 g 葡萄糖 2 g 氯化钠 5 g 蛋白胨 10 g 磷酸氢二钠 2.5 g 蒸馏水 1 mL A.4.2 配制 称取以上样品加热搅拌溶解于 1000 mL 蒸馏水中，调节 pH为 7.0后分装于三角瓶中， 121 高压灭 菌 15 min，备用。 A.5 半固体 BHI（脑心浸出液 Brain Heart Infusion， BHI）培养基 在 BHI液体培养基配方中添加入 0.5 %的琼脂 粉 ，将样品 按说明书 加水溶解后， 调节 pH至 7.0，分装 于试管中（不超过试管总体积的 1/3）， 121 高压灭菌 15 min，垂直冷却后，置 4 冰箱保存备用 。 A.6 三
20、氧化铁试剂配制 称取三氧化铁（ FeCl36H2O)12 g溶于 2 %盐酸溶液 100 mL中即可。 DB46/ T 2802014 8 附 录 B （规范性附录） 分子试剂 表 B.1 分子试剂 编号 试剂 浓度 1 Taq DNA 聚合酶 5 U/L 2 Ex taq DNA 聚合酶 5 U/L 3 2GC-rich buffer （ Mg2+ Plus） 5 mM 4 dNTP Mixture 2.5 mmol/L 5 细菌 16S rRNA 基因通用引物对 PLS（ 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3） 20 mol/L 6 细菌 16S rRNA 基因通用引物对 PL
21、A （ 5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3） 20 mol/L 7 无乳链球菌的 cfb 特异基因引物对 P1（ 5-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3） 20 mol/L 8 无乳链球菌的 cfb 特异基因引物对 P2（ 5-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3） 20 mol/L 9 海豚链球菌 16SrRNA 基因 的特异引物对 P3 （ 5-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3） 20 mol/L 10 海豚链球菌 16SrRNA 基因 的特异引物对 P4 （ 5-GGATTTTCCACTCCCATTAC-3） 20 mol/L 11
22、琼脂糖 / 12 溴化乙锭替代染料 / 13 2000 bp DNA 分子量标准（ marker） / 14 PMD18-T 载体 / 15 DH5 感受态细胞 / 16 溶菌酶 50 mg/mL 17 蛋白酶 K 20 mg/mL 18 API 20 STREP（ API 链球菌及相关微生物鉴定试剂条） / 19 Rapid ID 32 STREP（ ATB 鉴定系统链球菌快速鉴定试剂条） / DB46/ T 2802014 9 附 录 C （规范性附录） 生理生化试验结果 表 C.1 生理生化试验结果 项目 Items 无乳链球菌 Streptococcus agalactiae 海豚链球
23、菌 Streptococcus iniae 项目 Items 无乳链球菌 Streptococcus agalactiae 海豚链球菌 Streptococcus iniae 革兰氏染色 麦芽糖 10 下生长 阿拉伯糖 45 下生长 棉子糖 6.5% NaCl 七叶灵 pH9.6 蔗糖 运动性 甘露醇 接触酶 淀粉 溶血类型 / / 脲酶 马尿酸钠 水杨苷 精氨酸 海藻糖 MR试验 菊糖 VP试验 乳糖 山梨醇 木糖 核糖 蔗糖 葡萄糖 注： “+”表示反应结果为阳性； “ ”表示反应结果为阴性。 Note: “+”represents positive reaction; “ ”represents negative reaction. _
