1、ICS 65.020.30 B41 备案号：25946-2009 广东省地方标准 DB44 DB44/T 6642009 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感 （H5 亚型）的 HI 和多重 RT-PCR 鉴别诊断技术操作规程 HI and multiplex RT-PCR for detection and differentiation between GPMV and H5 subtype ofAIV in goose 2009-08-06 发布 2009-12-01 实施 广东省质量技术监督局 发布 DB44/T 6642009 I 前言 本标准附录A、附录B和附录C为规范性的附录。 本标
2、准由广东省农业厅提出并归口。 本标准起草单位：华南农业大学兽医学院。 本标准主要起草人：任涛、徐成刚、罗开健、曹伟胜、袁少华、廖明、张桂红、辛朝安。 DB44/T 6642009 1 鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感（H5 亚型）的 HI 和多重 RT-PCR 鉴别诊断技术操作规程 1范围 本标准规定了应用血凝抑制试验（HI试验）和反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术鉴别诊断鹅的 禽副粘病毒病与H5禽流感的材料准备、操作方法及结果判定。 本标准适用于鹅的禽副粘病毒病与高致病性禽流感(H5亚型)的鉴别诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期
3、的引用文件，其随后所有的修 改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否 可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术。 3 术语和定义 GB/T 18936 确定的以及下列术语和定义适用于本标准。 3.1 鹅的禽副粘病毒病 是近年来的新病，是由鹅的禽副粘病毒（Goose Paramyxovirus ,GPMV）引起的鹅的一种高发病率、 高死亡率的烈性传染病，以消化道充血、出血为特征的急性传染病。 3.2 高致病性禽流感 Highly Pathogenic Avian I
4、nfluenza Virus 是由正黏病毒科流感病毒属的禽类高致病性 A 型流感病毒(主要为 H5 亚型)引起的一类急性、高接触 性的禽类烈性传染病，具有高发病率和高死亡率的临床特征。 3.3 红细胞凝集试验 是指感染禽类的某些病毒与红细胞发生结合出现红细胞凝集的现象。 3.4 血凝效价 是指红细胞凝集试验中出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以 log2 为单位。 3.5 红细胞凝集抑制试验 即 HI 试验，是指使用特异性免疫血清可以抑制某些感染禽类的病毒与红细胞凝集的现象。 3.6 血凝抑制效价 是指 HI 实验中不出现红细胞凝集现象的最高稀释倍数，一般以 log2 滴度为单位。 3.7
5、 四单位抗原 根据抗原 HA 效价结果进行稀释，配制出血凝效价为 2 个 log2 单位的抗原稀释液。 DB44/T 6642009 2 3.8 反转录聚合酶链反应 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction 是指利用反转录酶将病毒 RNA 反转录成 cDNA，再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增的检测方法。RT-PCR 使 RNA 检测的敏感性提高了几个数量级，使一些极为微量的 RNA 样品分析成为可能。 3.9 特异性引物 是指针对特定模板 DNA 基因片段设计的一小段与 DNA 片段两侧互补的人工合成寡核苷酸。 3.10 无 RNa
6、se 水 是指 除去 RNA酶活性的双蒸水。 4HI试验 4.1 仪器设备及材料 4.1.1 仪器设备：离心机，最大转速至少应达到 5000g；微量振荡器；96 孔 V 型板；5L 50L 八道移 液器。 4.1.2 材料：1mL、10mL吸管；10mL离心管；2mL一次性注射器。pH值为7.4,浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓 冲溶液（PBS）； 3.8%柠檬酸钠抗凝剂；1鹅红细胞悬液；GPMV和HPAIV 抗原、标准血清以及阴性血清。 试剂的配方见附录B 4.2 采样与样品制备：每只鹅心脏或翼下采血 1mL 2mL,静置或离心，待血清析出后备用。 4.3 操作规程 4.3.1 HA 效价
7、的测定 在96孔V型反应板的1孔12孔均加入25L PBS，换吸头；吸取GPMV或HPAIV 25L于第1孔中混匀后 吸出25L至第2孔，依次倍比稀释到第11孔，从第11孔吸取25L弃去并换吸头；同样，换吸头后取25L AIV进行在另外一排孔中进行同样的操作，有必要的话，每种抗原可以重复做一排；每孔加入25L PBS； 吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔， 每孔25L； 置于微量振荡器上振荡30s， 室温 （2025） 静置40min 后观察结果；对照孔（12孔）红细胞应成明显纽扣状沉到孔底，此时根据完全血凝的最高稀释倍数得出HA 效价。 4.3.2 四单位抗原校正 用微量移液器向反应板的 2
8、孔6 孔加 PBS 25L,第 1 孔不加；根据 4.3.1 HA 效价的测定结果 配制 四单位 GPMV 及 HPAIV 抗原，用微量移液器吸取 25L 四单位抗原 分别加入第 1 孔、第 2 孔中，从第 2 孔 开始混匀后吸出 25L 至第 3 孔，依次倍比稀释到第 5 孔，弃去 25L；每孔加入 25L PBS；用微量移 液器再吸取 1%鹅红细胞悬液依次加入 1 孔6 孔，每孔 25L；于微量振荡器上振荡 30s；室温（20 25）静置 40min 后观察结果；如第 1、2、3 孔为完全凝集，第 4 孔红细胞为 50%沉淀，第 5 孔红细胞产 生 75%的沉淀，第 6 孔为对照完全沉淀，
9、出现以上结果，表明所配四单位抗原准确，校正成立。否则，重 新测 HA 效价并且配制四单位抗原，然后再做校正直至出现以上结果。 4.3.3 HI 试验 每排孔检测1份血清,同时设立阳性血清对照和阴性血清对照,试验步骤如下:在微量反应板的1孔11 孔加入25L PBS，第12孔加入50L PBS；吸取待检血清25L置于第1孔中，混匀后吸取25L于第2孔， 依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25L，弃去； 1孔11孔均加入4.3.2中配制好的四单位抗原25L， 室温（2025）静置至少30min。吸取1%鹅红细胞悬液依次加入各孔，每孔25L；置于微量振荡器上 振荡30s，混合均匀，室温（2025
10、）静置40min后观察结果。 4.4 结果判定 将反应板倾斜成45角，只有抗原对照孔（11孔）红细胞将成明显的纽扣状沉淀,红细胞对照孔（12孔） 成泪滴状流淌，才可以进行HI结果的判定。同时，只有阴性对照孔血清效价不大于2log 2 ，阳性对照孔血清 DB44/T 6642009 3 误差不超过1个log 2 ，试验结果才有效。HI效价小于或等于3log 2 ，判定HI试验阴性；HI效价等于4log 2 ，判 定为可疑，需重复试验；HI效价大于或等于5log 2 ，判定HI试验阳性。 5 RT-PCR 实验 5.1 仪器设备及材料 5.1.1 仪器设备：生物安全柜；PCR 仪；电泳仪；凝胶成像
11、系统；小型台式高速低温离心机；水浴锅。 5.1.2 耗材：微量移液器(配有滴头)；0.5mL 或 0.2mL PCR 反应管；一次性手套；1.5mL 灭菌离心管。 5.2 材料 5.2.1 RNA 提取试剂；氯仿(分析纯或以上试剂)；DEPC 处理的无 RNase 去离子水；异丙醇(分析纯或以上 试剂)；无 RNase 水配制的 75% 乙醇；反转录随机引物(pd(N)6, 20mol/L)、AMV 反转录酶 、核糖核酸酶 抑制剂（RNasin）；Ex-Taq 酶；2.5mmol/ L dNTP 混合物；凝胶加样缓冲液；1X Tris-冰乙酸电泳缓冲液； 10mg/mL 溴化乙锭（EB）；1.
12、0% 琼脂糖凝胶（含 0.5 g/mL EB）；DNA 分子量标准（ DL2000）；PCR 扩增 引物（浓度分别为 25pmol/ L，见附录 B.1）。试剂的配制见附录 B。 5.2.2 病料的处理：按照国标 GB/T 18936 的 2.1 进行。 5.3 操作规程 5.3.1 核酸抽提 取 250L5.2.2 中制备的病料组织上清液,置于一灭菌的 1.5mL 离心管中，同时设立阴性对照及鹅的 禽副粘病毒、H5 亚型禽流感病毒阳性对照，再分别加入冰冷的裂解液 750L，剧烈混合样品 15s，室温放 置 5min。加入 200L 氯仿，反转离心管混合 2 次，剧烈混合 10s，4 下以 1
13、0 000g 离心 15min；吸取上 层水相 500L 加入另一支灭菌的 1.5 mL 离心管中， 加入异丙醇 500L， 4 放置 10min， 4 下以 10 000g 离心 15min；小心弃去全部上清液，加入 1 mL 75%乙醇，上下轻缓反转两次, 4 下以 10 000g 离心 5min； 弃去全部上清，在超净工作台放置 5 min10min，至管壁上无肉眼可见液体，即制得总 RNA；加入 DEPC 水溶液 20L，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，冰浴保存备用，若需长期保存须放置在-70条件下。 5.3.2 RT 在一个1.5mL灭菌离心管中依次加入5AMV 缓冲液2L， 2.5
14、mmol/LdNTP混合物2L， pd(N)6 1L， RNasin 0.25 L，AMV 反转录酶 2.5U，轻缓混匀；加入 6.25L 5.3.1 制得 RNA；于室温放置 10 min ； 放入 42 水浴中 1 h，然后冰浴 2 min，所得的反应液即为反转录产物 cDNA。cDNA 可置于-20保存或直 接做 PCR。 5.3.3 PCR 在一个 0.5mL 或 0.2mL 灭菌 PCR 管中依次加入: 无 RNase 水 19.3 L，10EX-Taq 缓冲液 2.5 L， dNTP 混合物 1 L，引物 PP1、PP2、 PP3 和 PP4 各为 0.5L，EX-Taq 酶 0.
15、2 L（2.5U），轻缓混匀。加 入 1L 5.3.2 步骤中制备中的 cDNA，轻缓混匀，500g 离心 10 秒。置于 PCR 仪中先 94 ，3 min 进行预 变性，再按 94 40 s, 53 30 s, 72 30 s,运行 30 个循环,最后 72 延伸 7 min。同时设立阳 性对照和阴性对照。 PCR 产物的检测： 待 PCR 反应结束后， 每个 PCR 管取 5 L 反应液于 1.0% 琼脂糖凝胶 （含 0.5 g/mL EB） 中，同时加入 DNA 分子量标准（ DL2000）5 L 作为参照，在 120V 恒压下电泳 20min，取凝胶置于凝胶成 像仪中观察或成像。 注
16、：RT-PCR 操作程序要求在超净工作台中进行，并使用一次性手套，离心管、PCR 反应管及微量加样吸头等应使用一 次性塑料制品，使用前经 121高压 30min 灭菌，核酸抽提进行前，用酒精棉将工作台和移液器擦拭一遍。 5.4 结果判定 当阴性对照无任何 DNA 扩增条带或在 250bp 附近和 500bp750bp 间不出现 DNA 扩增带，GPMV 阳性对 照在 250bp 附近位置和 H5 亚型 AIV 阳性对照在 500bp750bp 间位置上出现 DNA 扩增条带时，若被检样品 在 250bp 附近的位置上出现 DNA 扩增，判断为 GPMV 阳性，记为（GPMV）；若被检样品在 5
17、00bp750bp 间的位置上出现一条 DNA 扩增，判断为 AIV-H5 阳性，记为（AIV）。检测结果凝胶电泳图参见附录 A.2。 DB44/T 6642009 4 注：废弃溴化乙锭或含有溴化乙锭的电泳缓冲液、凝胶等要集中回收处理。 DB44/T 6642009 1 附录A (规范性附录) 引物序列及 RT-PCR 检测结果判断图示 A.1 PCR特异性引物 A.1.1 PCR特异性引物核苷酸序列 PP1：5 GCT CGG TTC GTC GAC AAT CT 3 ( 20nt) PP2：5 GGG ATC GCG CTT GTT TCA A 3 ( 19nt) PP3：5 TGG CA
18、G GGA ATG GTA GAT G 3 ( 19nt) PP4：5 TAG GGA ACT CGC CAC TGT TG 3 ( 20nt) 人工合成引物，使用前利用灭菌的DEPC处理水稀释至25pmol/ L，分装成小量放置于-20保存备用， 避免反复冻融。 A.1.2 PCR特异性引物扩增的目的基因 PP1/PP2为针对GPMV NP基因部分片段的特异性引物，预计扩增片段约为250bp； PP3/PP4为针对H5亚型AIV HA基因部分片段的特异性引物，预计扩增片段约为541bp。 A.2 PCR检测结果琼脂糖凝胶电泳图 图 B.1 PP1/PP2 为引物 RT-PCR 检测结果 图
19、B.2 PP3/PP4 为引物 RT-PCR 检测结果 琼脂糖凝胶电泳图 琼脂糖凝胶电泳图 M：分子量标准 DNA Marker DL2000 M：分子量标准 DNA Marker DL2000 1：GPMV 阳性对照（） 1：H5 亚型 AIV 阳性对照（） 2：GPMV 可疑被检样品 2：H5 亚型 AIV 可疑被检样品 3：NDV 3：H9 亚型 AIV 4：H5 亚型 AIV 4：GPMV 5：H9 亚型 AIV 5：NDV 6：阴性对照（） 6：阴性对照（） DB44/T 6642009 1 附录B (规范性的附录) 溶液的配制 B.1 pH7.2 的 0.01mol/L PBS 用
20、天平称量1.096g磷酸氢二钠、0.316g磷酸二氢钠 和8.5g氯化钠(分析纯或以上试剂)，溶解于950mL 蒸馏水中，待溶解完全后用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2，最后定溶至1 000mL，灭菌或过滤后使用。 B.2 抗凝剂 用天平称量3.8g柠檬酸三钠(分析纯或以上试剂)，溶解定溶于100mL PBS中，待溶解完全后即可使用。 B.3 1红细胞悬液 由鹅翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血1：2的比例），迅速混匀。在水平 离心机中以3 000g 5min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加PBS，慢慢混 合均匀，再在离心机中3 000g离心5min，
21、弃去上清液，再加PBS混匀，如此反复洗涤离心3次，最后一次离 心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。使用时用1mL吸管吸取1mL红细胞泥，然后加入99mL PBS中， 即为1%红细胞悬液。红细胞悬液最好现用现配，置于4冰箱中可保存34天。 B.4 75%乙醇溶液 在750mL无水乙醇中加入DEPC处理水溶液定容至1 000mL，-20保存。 B.5 1DEPC处理水溶液 将1mL二乙基焦碳酸脂（DEPC）加入双蒸水并定容至1 000mL，置于摇床37振摇过夜，然后121高 压30min，分装备用。 注：DEPC 是一种潜在的致癌物质，操作时应戴手套和口罩并尽量在通风的条件下进行，避免呼吸和皮
22、肤的接触。 B.6 10%SDS溶液 将100.0g电泳级SDS加入900mL双蒸水中，加热至68助溶，用浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，然后加 水定容1 000mL。分装备用，室温保存。 B.7 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)溶液 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2H2O）： 186.1g 氢氧化钠： 20.0g 双蒸水： 定容至1 000mL B.8 凝胶加样缓冲液 蔗糖： 40.0g 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)： 20 mL 10%SDS： 5mL 溴酚蓝： 50.0mg DB44/T 6642009 2 双蒸水： 75mL 先将蔗糖完全溶解于双蒸水，然后
23、按顺序加入其余各成分，待所有成分溶解混合均匀后，用0.22 M的 微孔滤膜过滤除菌，4保存。 B.9 Tris-冰乙酸电泳缓冲液 B.9.1 50TAE缓冲液： Tris: 242g 冰乙酸： 57.1 mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)： 100mL 双蒸水： 定容至1 000mL B.9.2 1TAE缓冲液 50 TAE缓冲液： 20 mL 双蒸水： 定容至1 000mL B.10 10mg/mL溴化乙锭 在90mL双蒸水中加入1.0g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解后定容至100mL。用铝箔包裹 容器或移至棕色瓶中，保存于室温备用。 溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使
24、用还有这种染料的溶液时应戴上手套，称量时要戴面罩，废 弃溴化乙锭或含有溴化乙锭的电泳液、凝胶等要集中回收处理，处理方法见附录D。 B.10 1琼脂糖凝胶 将制胶板水平放置在工作台上，放上合适的梳子。 称量1.0g琼脂糖于三角瓶中，加入100mL 1 TAE电泳缓冲液，加热溶解琼脂糖，待琼脂糖溶液冷却至 50左右时，加入10mg/mL溴化乙锭溶液5L ，充分混合。将琼脂糖凝胶溶液沿胶板边沿缓慢连续注入， 凝胶厚度控制在4mm左右，待凝胶完全凝固后，将凝胶板放置入已加入1 TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使之 没过胶面，拔出梳子，以备加样电泳。 注：本附录中所用的试剂应为分析级（AR）或优质级（GR）
25、 。 DB44/T 6642009 1 附录C (规范性的附录) 溴化乙锭溶液的净化处理 C.1 浓度大于 0.5mg/mL溴化乙锭溶液的净化处理 加入足量的水使溴化乙锭溶液的浓度降低至0.5mg/mL以下，在此溶液中加入0.2倍体积新配制的5次 磷酸和0.12体积新配制的0.5mol/L亚硝酸钠，调节该溶液的pH至3.0以下，小心混匀。在室温作用24h，加 入10倍量的1mol/L碳酸氢钠溶液，混合均匀，倒去溶液。 C.2 含有 0.5 g/mL溴化乙锭电泳缓冲液的净化处理 每1 000mL溶液中加入100mg粉状活性炭，在室温作用1h，不时摇动，用滤纸过滤溶液，丢弃溶液，另 用塑料袋封装滤纸和活性炭焚化处理。
