1、ICS 65.020.20 B 31 DB44 广东省地方标准 DB44/T 22072019 辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒鉴定技术规程 The regulation for resistance evaluation of pepper to chilli veinal mottle virus 2019 - 10 - 31发布 2020 - 01 - 31实施 广东省市场监督管理局 发布 DB44/T 22072019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草 。 本标准附录 A为 规范性附录，附录 B、C 、D 为资料性附录。 本标准由广东省农业农村厅提出并归口。 本
2、标准主要起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所、湖南省植物保护研究所。 本标准主要起草人： 何自福、汤亚飞、佘小漫、刘勇、蓝国兵、邓铭光、于琳、李正刚。 DB44/T 22072019 1 辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒 （Chilli veinal mottle virus ， ChiVMV） 鉴定技术的术语与 定义、毒原准备、室内抗性鉴定、病情调查、抗性评价和鉴定报告撰写。 本标准适用于辣椒 （ Capsicum annuum L.） 品种及材料对辣椒脉斑驳病毒 的抗性室内鉴定及评价。 2 术语与定义 下列术语和定义适合于本标准。 2
3、.1 辣椒脉斑驳病毒 Chilli veinal mottle virus，ChiVMV 辣椒脉斑驳病毒为马铃薯 Y病毒科 （ Potyviridae）马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus）成员，具有马铃薯 Y病毒属成员基因组结构的典型特征，主要依靠蚜虫以非持久方式传播，也可以通过病株汁液和机械接 触等方式传播，但不能通过种子传播，其自然寄主主要是辣椒、番茄等茄科作物。辣椒受到 ChiVMV侵染 后，主要表现为叶 脉呈现暗绿条纹，叶缘皱缩，叶片畸形、变小，幼嫩叶片症状更为明显；早期感染会 抑制植株生长，主茎和分枝上呈现暗绿条纹；最终导致落花、落果，果实畸形等。 2.2 毒原 virus so
4、urce 毒原ChiVMV- GD：采自广东辣椒主产区的典型病样，经检测、纯化、鉴定、扩繁后，保存的用于后 续实验的样品。 2.3 人工机械摩擦接种 artificial mechanical inoculation 通过人工操作，在供试植物叶面上造成微小伤口，使病毒从伤口进入细胞内而引起发病的过程。 2.4 抗病性鉴定 identification of disease resistance 采用合适的技术方法，鉴定作物对特定病害的抗性水平。 3 毒原ChiVMV-GD准备 从广东辣椒主产区采集表现皱缩、花叶、斑驳、褪绿等症状的病叶，经分子检测确定病样中存在 ChiVMV，然后通过人工机械摩
5、擦接种到能产生枯斑的健康三生烟（ Nicotianan tabacum. cv. Samsum） 叶片上；对病样进行分离与纯化，经 RT-PCR检测 ，测序 确定无误后，将纯化的 ChiVMV接种到健康辣椒植 DB44/T 22072019 2 株上繁殖，待已接种辣椒新叶显症后， 再进行 RT-PCR检测， 确定无误后，采集辣椒病叶，放置-80 保 存备用 。具体 见附 录 A。 4 仪器设备 电子天平，恒温培养箱 ，研钵，超低温冰箱，量筒，普通冰箱， PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统， 移液器，离心机，恒温水浴锅。 5 室内抗性鉴定 5.1 接种室 室内抗性鉴定应 具备良好的发病环境 的60
6、目防虫日光温室中进行。 5.2 育苗 待测辣椒种子经 10%磷酸三钠溶液 （见附录 D） 中浸泡 20 min，清水冲洗后放置在28恒温培养箱催 芽至露白，然后直播于8 cm12 cm黑色塑料育苗杯中，每杯 2粒。播种用基质土为经121 湿热灭菌消 毒30 min的新鲜育苗基质土。育苗在 60目防虫日光温室进行，室内温度 应控制在25 30 ， 确保幼苗 生长健壮、长势一致。 5.3 鉴定品种设置 鉴定品种随机排列设置， 4次重复，每个处理30 株。 5.4 接种 5.4.1 接种时间 在辣椒 3片 4片真叶期进行接种。 5.4.2 接种病原制备 1 g新鲜病叶或 -80 保存的病原病毒感病的
7、发病叶组织加 10 mL磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2， 见附录 D），在灭菌的研钵中匀浆，再经灭菌纱布过滤，其滤液为接种悬浮液。 5.4.3 接种方法 在叶面上撒少量 400目600 目金 刚砂，然后用棉签蘸取接种悬浮液在叶片上顺叶脉方向轻轻摩擦， 再用清水将叶面 多余的悬浮液和金刚砂轻轻洗去，每株接种上部2 片真叶。 5.4.4 接种后的管理 供试幼苗置于 接 种室 内继续培养，保持接 种室 温度为 25 30 ，自然光照，常规水肥管理。 6 病情调查 6.1 调查时间 接种后 15 d30 d 进行，每隔 15 d调查一次。 DB44/T 22072019 3 6.2 病
8、情分级标准 辣椒病情级别及其相对应的症状描述见表 1。 表1 辣椒脉斑驳病毒引起的辣椒病毒病病情分级标准 病情级别 症状描述 0 级 全株无症状 1 级 心叶明脉或轻微花叶 3 级 少于1/3叶片花叶 5 级 1/3 1/2叶片花叶，叶片皱缩 7 级 1/2 2/3叶片花叶，叶片皱缩 9 级 2/3以上叶片花叶，叶片皱缩，有泡状突起 6.3 调查方法 接种15 d后，每隔15 d对每个接种植株发病情况进行调查，根据发病症状，按照附 录B的格式记载 病情级别，按公式（1）计算出病情指数，待各处理病株的病情基本稳定，可以根据此时的病情指数对 待鉴定品种的抗性水平进行评价。 DI=（s n） /（N
9、 S） 100 . (1) 式中： DI 病情指数； s 各病情指数级别的代表数值； n 各病情级别的植株株数； N 调查总植株数 ； S 最高病情级别的代表数值。 7 抗性评价 7.1 抗性评价标准 根据待测材料4 次重复的病情指数平均值确定其抗性水平，划分标准见表 2。 表2 辣椒对辣椒脉斑驳病毒病抗性的评价标准 病情指数（DI） 抗性评价 DI=0 免疫 Immune (I) 0DI10 高抗 Highly resistant（ HR） 10DI20 抗病 Resistant（R ） 20DI40 中抗 Moderately resistant（ MR） 40DI60 感病 Suscep
10、tible（S ） 60DI 高感 Highly susceptible（ HS） 7.2 鉴定有效性鉴别 当同批次设置的感病品种达到相应感病程度（ DI 40 ），该批次抗性鉴定视为有效。 8 鉴定报告的撰写 参照附录C 的格式出鉴定报告。 DB44/T 22072019 4 A A 附 录 A （规范性附录） 辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV -GD）的毒原准备 A.1 病样采集 从广东辣椒主产区采集表现皱缩、花叶、斑驳、褪绿等症状的辣椒病株细嫩叶片。 A.2 RT-PCR 检测 利用辣椒脉斑驳病毒（ Chilli veinal mottle virus， ChiVMV）的特异引物 ChiVM
11、V-F（ 5- CGAGTCTCATAAGT AATTGCAC-3） /ChiVMV-R（5 AAGACATTTACTGATACCCTCC-3） 对病样进行 RT-PCR 检测，若能扩增出一条预期大小为752 bp的特异片段，病样中确定存在 ChiVMV（图A. 1）。 RT-PCR反应 扩增体系为：PrimeScript 1 step Enzyme mix 2 L ，21 step Buffer（Dye Plus） 25 L ，10 M 引物ChiVMV- F/ChiVMV-R各 1 L，模 板1 L，加 RNase-free ddH2O至总体积为50 L 。反应条件为： 50反转录 30
12、min；94 预变性 4 min，94 变性 30 min、52 退火30 sec 、72 延伸 1 min，35 个循环， 72 最终延伸 10 min，取 8 L 扩增产物在质量分数为 1.5%的琼脂糖凝胶上 100 V 125 V恒压电泳 30 min，在紫外检测仪下观察并记录结果。 图A.1 辣椒病样中ChiVMV 的RT-PCR检测结果 1-5：疑似病样； 6：阳性对照； 7，8 ：阴性对照 A.3 病原分离纯化 采用人工摩擦将病液接种到枯斑寄主三生烟上，分离与纯化病样中的ChiVMV 。接种后 14 d左右，接 种叶片上产生坏死枯斑（图A.2 ）， 将产生的单斑切下，接种到健康 三
13、生烟 植株上，进行二次纯化 。 DB44/T 22072019 5 图A.2 ChiVMV接种三生烟的症状 A.4 扩繁保存 将经过二次纯化后的单斑 叶组织汁液 摩擦接种于健康的辣椒感病品种 植株上， 接种10 d开始产生症 状，主要表现为新叶片上出现不规则暗绿斑驳，深绿部分通常伴有泡状凸起症状，叶边缘皱缩或卷起， 有的叶片变小畸形，甚至出现线叶，有些叶片的叶脉明显突出（图A.3 ）。新叶显症后，进行 RT-PCR检 测，确保ChiVMV 得到纯化。 取显症叶片制备接种病原 ，或 保存于 -80 冰箱中备用。 图A.3 ChiVMV接种辣椒的症状 DB44/T 22072019 6 B B 附
14、 录 B （资料性附录） 调查记录表 表B.1 辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒鉴定调查记录表 播种时间 接种时间 调查时间 品种名称 处理 各级病情株数 总株数 病情 指数 平均 病指 0 1 3 5 7 9 品种1 1-1 1-2 1-3 1-4 品种2 2-1 2-2 2-3 2-4 鉴定技术负责人（签字）： 复核人（签字）： DB44/T 22072019 7 C C 附 录 C （资料性附录） 鉴定报告 表C.1 辣椒品种抗病毒鉴定报告 鉴定作物 辣椒 鉴定内容 _个品种对辣椒脉斑驳病毒的抗性水平 鉴定时间 _年_ 月_ 日 至 _年 _月_日 鉴定单位（盖章） 鉴定人（签字） 报告正文（必
15、须附上原始调查数据相关附件） DB44/T 22072019 8 D D 附 录 D （资料性附录） 溶液的配制 D.1 10% 磷酸三钠溶液 称取30 g 磷酸三钠加入水中溶解， 定容到 100 mL。 D.2 磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2） 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na 2HPO4） 2.9 g 加水定容到 1 L。 DB44/T 22072019 9 参 考 文 献 1 汤亚飞 , 裴凡 , 于琳 , 等 . 侵染广东辣椒的辣椒脉斑驳病毒的分子特征 . 园艺学 报,2018,45(11):2209-2216. 2 杨好慧 ,邱杨, 宋江萍
16、,等 .萝卜种质资源对芜菁花叶病毒的抗性鉴定与评价. 植物遗传资源学 报,2017,18(05):810 -818. 3 裴凡 . 侵染广东辣椒的病毒种类鉴定及病毒病药剂防控效果评价. 华南农业大学 ,2016. 4 杨华兵 ,刘 勇 ,李文正 ,等 .烟草品种辣椒叶脉斑驳病毒病的症状与抗病性鉴定. 云南农业大学 学报( 自然科学版 ), 2014,29 (1):22-26. 5 方中达 . 植病研究方法（第三版） . 北京：中国农业出版社, 1996. _ DB44/T 22072019 10 广东省地方标准 辣椒品种抗辣椒脉斑驳病毒鉴定 技术规程 DB44/T 22072019 * 广东省标准化研究院组织印刷 广州市海珠区南田路 563 号 1304 室 邮政编码： 510220 网址： www.bz360.org 电话： 020-84250337 D B44 / T 220 7 20 1 9
