1、ICS 65.020.20 B 31 DB44 广东省地方标准 DB44/T 22062019 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒 鉴定技术规程 The regulation for resistance evaluation of wax gourd to zucchini yellow mosaic virus 2019 - 10 - 31发布 2020 - 01 - 31实施 广东省市场监督管理局 发布 DB44/T 22062019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草 。 本标准附录 A为规范性附录，附录 B、C 、D 为资料性附录。 本标准由广东省农业农村厅提
2、出并归口。 本标准主要起草单位：广东省农业科学院植物保护研究所、湖南省植物保护研究所。 本标准主要起草人： 何自福、汤亚飞、佘小漫、刘勇、蓝国兵、邓铭光、于琳、李正刚。 DB44/T 22062019 1 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus ， ZYMV）鉴定技术的 术语和定义、毒原准备、人工接种抗性鉴定、病情调查、抗病性评价及鉴定报告的撰写 。 本标准适用于 冬瓜品种及材料对小西葫芦黄花叶病毒的人工接种抗性鉴定。 2 术语与定义 下列术语和定义适合于本标准。 2.1 小西葫芦黄
3、花叶病毒 Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV 小西葫芦黄花叶病毒为马铃薯Y 病毒科（ Potyviridae）马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus）成员，具有马 铃薯Y病毒属成员基因组结构的典型特征，主要依靠蚜虫以非持久方式传播，也可以通过病株汁液和机 械接触等方式传播，但不能通过种子传播，主要侵染冬瓜、黄瓜、西葫芦、甜瓜、西瓜等葫芦科作物 。 ZYMV侵染的植物出现花叶 、斑驳、褪绿黄化、叶面凸凹不平、卷曲畸形、新叶变小、 果实畸形、果面颜 色不均匀或产生褐斑 等症状，或植株出现矮化，新梢坏疽，甚至凋萎死亡。 2.2 毒原 virus source 毒原ZY
4、MV-DG ：采自广东冬瓜主产区的典型病样，经检测、纯化、鉴定、扩繁后，保存的用于后续 实验的样品。 2.3 人工机械摩擦接种 artificial mechanical inoculation 通过人工操作，在供试植物叶面上造成微小伤口，使病毒从伤口进入细胞内而引起发病的过程。 2.4 抗病性鉴定 identification of disease resistance 采用合适的技术方法，鉴定作物对特定病害的抗性水平。 3 毒原ZYMV-DG准备 从广东冬瓜主产区采集表现花叶、斑驳、泡状突起等症状的病叶，经RT -PCR确定病样中存在 ZYMV， 然后通过摩擦接种到能产生枯斑的健康苋色藜植
5、株叶片上， 经 2至3 次单斑分离，将分离后的病源接种到 健康的冬瓜植株上繁殖，待接种植株显症后进行分子检测，测序确定无误后，采集病叶，放置- 80保 存备用 。具体 见附录 A。 DB44/T 22062019 2 4 仪器设备 电子天平，研钵，超低温冰箱，量筒，普通冰箱， PCR 仪，电泳仪，凝胶成像系统，移液器，离 心 机，恒温水浴锅。 5 人工接种抗性鉴定 5.1 接种室 室内抗性鉴定应在 具备良好发病环境 的60 目防虫日光温室中进行。 5.2 育苗 将冬瓜 种子用温水浸种2 h 4 h， 放置在 28恒温培养箱催芽至露白 ， 直播于 8 cm12 cm黑色塑 料育苗杯中，每杯2 粒
6、。播种用基质土为经 121湿热灭菌消毒 30 min的新鲜育苗基质土。 育苗在 60目防 虫日光温室 内进行，室内温度 应控制在 25 30 ，确保 幼苗 为生长健壮、长势一致 的无病苗 。 5.3 鉴定品种设置 鉴定品种随机排列设置， 4次重复，每个处理30 株。 5.4 接种 5.4.1 接种时间 挑选健康无病的冬瓜苗，在子叶期进行接种。 5.4.2 接种病原制备 1 g新鲜或 -80保存的病原病毒感染的发病叶组织加 10 mL磷酸缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2，见 附录D ），在灭菌的研钵中匀浆，再经灭菌的纱布过滤，其滤液为接种悬浮液。 5.4.3 接种方法 在叶面上撒少量
7、400目6 00目金 刚砂，然后用棉签蘸取接种悬浮液在叶片上沿叶脉方向轻轻摩擦， 再用清水将叶面多余的悬浮液和金刚砂轻轻洗去。 5.4.4 接种后的管理 供试幼苗置于接种室内继续培养，保持接种室温度为25 30 ，自然光照，常规水肥栽培管 理。 6 病情调查 6.1 调查时间 接种后 7 d35 d进行，每隔 7 d调查一次。 6.2 病情分级标准 冬瓜苗期病情级别及其相对应的症状描述见表 1。 DB44/T 22062019 3 表1 小西葫芦黄花叶病毒引起的冬瓜病毒病病情分级标准 病情级别 症状描述 0 级 全株无症状 1 级 心叶脉明或轻花叶 3 级 心叶及中部叶片花叶 5 级 心叶及中
8、部叶片花叶，少数叶片畸形、皱缩，植株轻度矮化 7 级 重花叶、多数叶片畸形、皱缩，植物矮化 9 级 重花叶、叶片明显畸形，植株严重矮化，甚至死亡 6.3 调查方法 接种7 d 后对每个接种植株发病情况进行调查，之后每隔7 d 调查一次，根据发病症状，按照附 录B 的格式 记录病情级别，按公式（1 ）计算出病情指数，待各处理病株的病情基本稳定，可以根据此时的 病情指数对待鉴定品种进行抗病性鉴定。 DI=（s n） /（N S） 100 . (1) 式中： DI 病情指数； s 各病情指数级别的代表数值 ； n 各病情级别的植株株数 ； N 调查总植株数 ； S 最高病情级别的代表数值 。 7 抗
9、性评价 7.1 抗性评价标准 根据待测品种4 次重复的病情指数平均值确定其抗性水平，划分标准见表 2。 表2 冬瓜对小西葫芦黄花叶病毒抗性的评价标准 病情指数（DI） 抗性评价 DI=0 免疫 Immune（ I） 0DI10 高抗 Highly resistant（ HR） 10DI20 抗病 Resistant（R ） 20DI40 中抗 Moderately resistant（ MR） 40DI60 感病 Susceptible（S ） 60DI 高感 Highly susceptible（ HS） 7.2 鉴定有效性鉴别 当同批次设置的感病品种达到相应感病程度（ DI40 ），该批次
10、抗性鉴定视为有效。 8 鉴定报告的撰写 参照附录C 格式出鉴定报告。 DB44/T 22062019 4 A A 附 录 A （规范性附录） 小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV -DG） 的毒原准备 A.1 病样采集 从广东冬瓜主产区采集表现明显花叶、斑驳、泡状突起等症状的病叶。 A.2 病原 RT -PCR 检测 利用小西葫芦黄花叶病毒（ Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）的特异引物 ZYMV-F（ 5- GATCACAAAG AAAATGTCATTGCCAC-3）/ ZYMV R（5 TGCTTTCATCTGCGCAACAG-3）对病样进行 RT -PCR 检
11、 测，若能扩增出一条预期大小为520 bp 的特异片段，病样中确定存在ZYMV（图 A.1）。 RT-PCR反应扩增 体系为：PrimeScript 1 step Enzyme mix 2 L， 21 step Buffer（ Dye Plus） 25 L， 10 M引物 ZYMV-F/ZYMV-R 各1 L，模 板 1 L，加 RNase Free ddH 2O 至总体积为 50 L。反应条件为：55反 转录30 min；94 预变性 4 min， 94 变性 30 min、 52退火 30 sec、72 延伸1 min ，35 个循环，72 最终延伸10 min，取 8 L扩增产物在质量分
12、数为1.5% 的琼脂糖凝胶上 100 V125 V恒压电泳 30 min，在 紫外检测仪下观察并记录结果。 图A.1 疑似病样中ZYMV 的RT-PCR检测结果 1-5：疑似病样； 6：阳性对照； 7,8：阴性对照 A.3 病原分离纯化 采用人工接种方式通过机械摩擦接种方法将病样悬 浮液接种到枯斑寄主苋色藜上，分离与纯化病样 中的ZYMV。接种后10 d 左右，接种叶片上产生坏死枯斑（图A.2 ），将产生的单斑切下， 再 接种到健康 苋色藜 植株上，进行二次纯化。 DB44/T 22062019 5 图A.2 ZYMV接种苋色藜的症状 A.4 扩繁保存 将经过2次纯化后的单斑 叶组织汁液 摩擦
13、接种于健康的 冬瓜感病品种植株上 ，接种7 d开始产生症 状，主要表现为新叶片上出现不规则暗绿斑驳，深绿部分通常伴有泡状凸起症状（ 图A.3 ）。新叶显症 后，进行 RT-PCR病原 检测，确保 ZYMV得到纯化， 取显症叶片制备接种病原，或保存于-80 冰箱中 备用。 图A.3 ZYMV接种冬瓜的症状 DB44/T 22062019 6 B B 附 录 B （资料性附录） 调查记录表 表B.1 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒鉴定调查记录表 播种时间 接种时间 调查时间 品种名称 处理 各级病情病株数 总株数 病情 指数 平均 病指 0 1 3 5 7 9 品种1 1-1 1-2 1-3 1-4
14、 品种2 2-1 2-2 2-3 2-4 C 鉴定技术负责人（签字） ： 复核人（签字）：D 鉴定技术负责人（签字） ： 复核人（签字）： 鉴定技术负责人（签字）： 复核人（签字）： DB44/T 22062019 7 C E 附 录 C （资料性附录） 鉴定报告 表C.1 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒鉴定报告 鉴定作物 冬瓜 鉴定内容 _个品种对小西葫芦黄花叶病毒的抗性水平 鉴定时间 _年_ 月_ 日 至 _年_ 月_日 鉴定单位（盖章） 鉴定人（签字） 报告正文（必须附上原始调查数据相关附件） DB44/T 22062019 8 D F 附 录 D （资料性附录） 溶液的配制 D.1 磷酸
15、缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.2） 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na 2HPO4） 2.9 g 加水定容到 1 L。 DB44/T 22062019 9 参 考 文 献 1 尤毅 ,李华平 ,谢大森 .侵染冬瓜的病毒病原种类鉴定. 植物保护,2016,42( 02):182-186. 2 赵芹 ,谢大森 ,何晓明 ,等 .广东地区冬瓜感染的小西葫芦黄花叶病毒检测及其外壳蛋白基因多 样性分析. 园艺学报,2016,43(01):151 -160. 3 杨华兵 ,刘 勇 ,李文正 ,等 .烟草品种辣椒叶脉斑驳病毒病的症状与抗病性鉴定. 云南农业大学 学报( 自然科学版 ), 2014,29 (1):22-26. 4 方中达 . 植病研究方法（第三版） . 北京：中国农业出版社, 1996. _ DB44/T 22062019 10 D B44 / T 220 6 20 1 9 广东省地方标准 冬瓜品种抗小西葫芦黄花叶病毒 鉴定技术规程 DB44/T 22062019 * 广东省标准化研究院组织印刷 广州市海珠区南田路 563 号 1304 室 邮政编码： 510220 网址： www.bz360.org 电话： 020-84250337
