1、ICS 01.040.85 Y32 DB43 湖南省 地方标准 DB43/T 1657 2019 洞庭湖荻苇中不可溶性糖含量的测定 液相 色谱法 Determination of insoluble saccharides of reeds in Dongting Lake Liquid chromatography 2019 - 09 - 16 发布 2019 - 12 - 16 实施 湖南省市场监督管理局 发布 DB43/T 1657 2019 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语及定义 . 1 4 原理 . 1 5 仪器和试剂 . 1 6
2、样品准备 . 2 7 高效液相色谱仪操作条件 . 2 8 试验步骤 . 3 9 结果报告 . 4 10 试验报告 . 4 DB43/T 1657 2019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。 本标准起草单位：常德市产商品质量监督检验所/国家生活用纸质量监督检验中心。 本标准主要起草人：彭小悦、郭盛、孙华、罗云鹰、张乐华 、代泳波。 本标准由湖南省生活用纸标准化技术委员会归口。 本标准为首次发布。 DB43/T 1657 2019 1 洞庭湖荻苇中不可溶性糖含量的测定 液相色谱法 1 范围 本标准规定了测定洞庭湖荻苇原料中不可溶性糖含量的测定方法和规范。 本标准适
3、用于不含抽提物的荻苇原料。对于未经处理的含有抽提物的荻苇原料样品，必须事先去除 样品中的抽提物才能进行分析。本标 准同样适用于酸或碱处理后（洗涤至不含残余酸或碱）以及发酵剩 余物质中固体样品的不可溶性糖含量测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 2677.1 造纸原料用分析试样的采取 GB/T 2677.2 造纸原料水分的测定 GB/T 2677.5 造纸原料有机溶剂抽出物含量的测定 3 术语及定义 3.1 新鲜荻苇原料 当年现场取用的荻
4、苇原料。 3.2 绝干质量 不含水的生物质原料质量，按照 GB/T 2677.2标准方法所述步骤在 105 烘干获得。 3.3 准备好 的 生物质 样品 根据 GB/T 2677.1标准方法处理得到的固体含量大于 85%的生物质样品。 3.4 不含抽提物的 生物质 样品 根据 GB/T 2677.5标准方法处理得到的不含有抽提物的样品，该方法可去除荻苇原料中包括可溶性 糖在内的各种可溶性组分。 4 原理 荻苇原料中的不可溶性糖，通过两段硫酸水解后可转化为其相对应的单糖。采用高效液相色谱检测 水解液中的单糖含量后，通过计算可得到生物质原料中的不可溶性糖。 5 仪器和试剂 DB43/T 1657
5、2019 2 5.1 仪器和材料 5.1.1 分析天平：读数精度 0.1mg； 5.1.2 高压反应器：控温要求 121 3； 5.1.3 水浴锅：控温要求 30 1； 5.1.4 鼓风干燥箱：控温要求 45 3、 105 3； 5.1.5 干燥器：装有无水硫酸钙或其它干燥剂； 5.1.6 高效液相色谱：配备示差折光检测器； 5.1.7 进样瓶； 5.1.8 一次性注射器（ 1mL 和 3mL）； 5.1.9 一次性水相滤头（ 0.22 m）； 5.1.10 玻璃血清瓶 (125mL) 具备耐腐蚀性的橡胶密封塞（如有聚四氟乙烯覆膜层）和铝制密封圈。也可用其它具有耐高温、耐 高压、耐腐蚀性的可严
6、密密封的容器取代。 5.1.11 称量纸； 5.1.12 玻璃试管（ 16 100mm）； 5.1.13 锥形瓶（容积 50mL）； 5.1.14 pH 试纸。 5.2 试剂 除非特别说明，本标准所用试剂均为分析纯试剂。 所用水的纯 度必须满足 实验室用水二级水的标准。 5.2.1 碳酸钙 5.2.2 高纯度标准品（ 98%）： 葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖，均在 45 3下烘干至恒重。 5.2.3 浓硫酸 5.2.4 稀 硫酸（ 72%w/w 或 12.00 0.02mol/L）： 在冰浴及充分搅拌的条件下，缓缓将 665mL的浓硫酸 （ 5.2.4） 加入至 300mL水中；将溶
7、液温度调整 至 20 ，并将其相对密度调整至 1.6338。 6 样品准备 按照 GB/T 2677.1标准方法，将新鲜的生物质原料样品进行干燥、粉碎、筛分，得到准备好的生物 质原料样品；然后，依照 GB/T 2677.5所述标准步骤对准备好的生物质原料样品进行抽提，去除其含有 的抽提物，经干燥后得到不含抽提物的生物质原料样品。 7 高效液相色谱仪操作条件 DB43/T 1657 2019 3 以 HP Model 1090型高效液相色谱仪 （含示差折光检测器）、 BioRad Aminex HPX-87C或 HPX-87P型色 谱柱（配备合适的保护柱）为例，其操作条件为：进样体积 50L，淋
8、洗液为去离子水（氦气或真空脱 气、电阻 18M欧姆、 0.2m滤膜过滤），柱流量 0.6mL/min，柱温 85，数据采集 20分钟、后运行 15分钟。 8 试验步骤 8.1 标准曲线 8.1.1 标准溶液配制 分别准确称取 4.0g的 葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖，溶解至 1L的超纯水中，配制成 浓 度为 4.0g/L的混合糖标准溶液，并用一次性 0.22m水相滤头将其过滤。将该标准溶液按照相应比例进行 稀释，分别得到 7个水平（ 0.1、 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0g/L）的混合糖标准溶液。 8.1.2 高效液相色谱检测 对于具有自动进样器的高效液相
9、色谱仪，用移液枪移取约 1.5mL的上述七个水平的混合糖标准溶液、 并分装至进样瓶中，进行糖含量检测。对于需要手动进样的高效液相色谱仪，用一次性注射器移取约 1mL 的混合糖标准溶液，打入手动进样阀的阀口、进行糖含量检测。记录不同浓度下各种糖的液相色谱信号 值。 8.1.3 建立标准工作曲线 分别以五种糖的浓度为横坐标、液相色谱信号值为纵坐标 做图 ， 并利用线性回归工具拟合图中数据 点，得到各种糖的 标准 工作 曲线 ，即： nnnn bAkc += （ 1） 式中： n 糖种类标识； cn 某糖在溶液中的浓度（ g/L）； An 某糖的液相色谱信号值； kn 某糖标准工作曲线的斜率（ g/
10、L）； bn 某糖标准工作曲线的截距（ g/L）。 8.2 荻苇样品处理及检测 8.2.1 72%硫酸预水解 准 确称取 300 10mg不含抽提物的粉状生物质原料、重量精确至 0.1mg。将称量好的不含抽提物的 粉状生物质原料转移至玻璃试管中，准确加入 3.00 0.01mL（ 4.92 0.01g） 72%硫酸，并用搅动至固液 完全混合。将该试管放入 30 1 的水浴锅 中，水解时间为 1小时；为了确保样品完全混合、润湿，每隔 15分钟搅动一次。 8.2.2 水解产物稀释 将按照 8.2.1处理后的 全部 水解产物转移至玻璃血清瓶中，使用 84.00 0.04 mL的水将其稀释至 硫酸 浓
11、度 4%w/w。在转移、稀释过程中， 可采用多次洗涤的方式 将所有水解后固体及水解液 转移 至玻璃血 清瓶，由此获得的水解产物稀释液、其总重应为 89.22g或总体积 87mL。将装有稀释好的水解产物的玻 璃血清瓶用橡胶塞和铝盖密封。 DB43/T 1657 2019 4 8.2.3 高温水解 将 8.2.2所述密封好的 玻璃血清瓶放入高压反应器内，在 121 3 下水解 1小时。水解完成后，将玻 璃血清瓶取出、在室温下冷却 20分钟。 8.2.4 水解液中和与过滤 将玻璃血清瓶的密封铝盖及橡胶塞打开，移取 20mL的水解液至 50mL的锥形瓶中；将碳酸钙缓缓加 至瓶中，用 pH试纸检测水解液
12、 pH值、直至溶液 pH值在 56之间为止，切不可过度中和至 pH值高于 6。为 了避免产生泡沫 及由于液体过热产生水蒸气而导致的水损失，碳酸钙加入速度一定要缓慢。 用 3mL的一 次性注射器吸 取上清液 ，然后配合一次性 0.22m水相滤头将其过滤至进样瓶中。如糖浓度过高，可将 滤液按需求进行稀释（稀释比例记为 D），再加入至进样瓶中。 8.2.5 水解液糖含量测定 按照 8.1.2检测水解液或其稀释液中的糖含量，记录各种糖的检测信号 An,0。 9 结果报告 9.1 荻苇样品中糖含量的计算 以绝干原料计， 荻苇样品中的糖含量可用下式计算 %10 00.87)( 1 0,10, += nnn
13、nn Rm bAkDwc （ 3） 式中： n 糖种类标识； cn,0 荻苇原料中某糖的含量（ %）； D 水解液检测前的稀释倍数（ 8.2.4）； An,0 荻苇原料水解后的待测液中某糖的液相色谱信号值； 87.0 酸水解过程中液体在室温下的总体积（ mL）； m1 用于检测的不含抽提物的荻苇原料绝干质量（ g）； w1 不含抽提物的荻苇原料占绝干荻苇原料的比例（ %）。 9.2 结果的表示 单位绝干质量的荻苇原料中各种糖（以单糖计）所占的质量百分比，结果保留两位有效数字，三次 测定的相对标准偏差应小于 5%。 10 试验报告 试验报告应包括以下内容： 本标准编号； 所用仪器类型； 仪器操作条件； 试验结果； 测试中观察到的任何异常情况； 任何与本标准的偏差； DB43/T 1657 2019 5 本标准或引用的规范性文件中未规定的并可能影响结果的任何条件。 _
