1、湖南省地方标准 DB43 DB43/T 16712019 ICS 65.020.30 B 41 湖南省市场监督管理局 发 布 2019-10-15发布 2019-12-15实施 动物疫病病毒核酸提取 磁珠法 Extraction of Animal Disease Virus Nucleic Acid Magnetic-Bead-Based Method DB43/T 16712019 I 目 次 前言 1 范围 1 2 规范性引用文件 1 3 术语和定义 1 4 主要仪器设备 1 5 主要耗材与器械 1 6 主要试剂 1 7 样品与样品预处理 1 8 核酸提取 2 9 生物安全要求 2 DB
2、43/T 16712019 II 前 言 本标准按照GB/ 1.12009给出的规则起草。 本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖南省畜牧水产局提出。 本标准由湖南省农业农村厅归口。 本标准起草单位：湖南省动物疫病预防控制中心，长沙市动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：何世成、王昌建、陈智、林源、唐小明、谭丹、范叶、王卫国、彭志、朱春霞、 汪洪冰。 DB43/T 16712019 1 动物疫病病毒核酸提取 磁珠法 1 范围 本标准规定了磁珠法提取动物疫病病毒核酸的技术要求。 本标准适用于我省动物疫病诊断、监测中的PCR检测。 2 规范性引用文件
3、下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡所注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 磁珠法 在核酸提取过程中，使用胍盐等去垢剂裂解细胞、释放核酸，用磁珠在高盐、低pH的条件下特异 性吸附核酸，在低盐、高pH条件下解离核酸，实现核酸提取的方法。 4 主要仪器设备 核酸提取仪；台式1.5 mL离心机；微量可调移液器（110）L
4、、（ 10100）L、（ 20200） L、（ 1001 000）L等规格；组织研磨仪或其它研磨设备；冰箱；生物安全柜；高压灭菌锅。 5 主要耗材与器械 与移液器匹配的各规格吸头；1.5 mL或2 mL离心管；96孔深孔板；磁套。 6 主要试剂 包括裂解液、洗涤液、洗脱液、蛋白酶K溶液、磁珠悬液等，或等效的磁珠法商品化试剂盒。 7 样品及样品预处理 7.1 样品类型 DB43/T 16712019 2 血清、抗凝血、脏器组织、O-P液、拭子样品、精液、细胞培养液等样品，样品的采集、保存与运 输按照NY/T 541的规定执行。 7.2 样品预处理 不同样品类型处理方法如下： a） 血清、抗凝血、
5、拭子样品、O-P液、精液、细胞培养液等液体性样品无需进行预处理，直接用 于核酸提取。 b） 组织样品：取1g左右组织，剪碎，进行研磨匀浆，8 000 r/m离心1 min，上清液用于核酸提取。 8 核酸提取 8.1 根据核酸提取仪的操作程序，设置96孔深孔板的功能布局，包括1列裂解孔、1列磁珠孔、2列 洗涤孔、1列洗脱孔。 8.2 在裂解孔中加入500 L裂解液、20 L蛋白酶K、200 L样品，磁珠孔中加入600 L磁珠 稀释液、25 L磁珠悬液，洗涤孔中加入700 L洗涤液，洗脱孔中加入100 L洗脱液。 8.3 将深孔板放入核酸提取仪内，安装好磁套。 8.4 运行核酸提取程序：90 混匀
6、裂解 15 min；转移磁珠孔中的磁珠至裂解孔，释放磁珠，混匀， 再磁吸90 s；转移磁珠至第一个洗涤孔，释放磁珠，加热至85 混匀洗涤2 min，磁吸90 s；转移磁 珠至第二个洗涤孔，释放磁珠，加热至85 混匀，磁吸30 s；转移磁珠至洗脱孔，释放磁珠，加热至 85 混匀洗脱，洗脱时间5 min，磁吸90 s；转移磁珠至磁珠孔，释放磁珠。 8.5 程序运行结束后，洗脱孔中的溶液为提取获得的病毒核酸溶液，可立即用于实验检测，也可冷冻 保存备用。 以上操作也可按等效的磁珠法商品化试剂盒要求进行。 9 生物安全要求 提取结束后，磁套、96 孔板等应使用自封口袋进行密闭封存，提取过程及废弃物处理应遵守 GB 19489、NY/T 1948等生物安全管理的相关要求。
