1、湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布2010-12-17 发 布 2011-01-18实 施 ICS 67.080.20B31湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 672-2010双 孢 蘑 菇 菌 种 提 纯 复 壮 技 术 规 程 Technical regulation of purification and rejuvenation forAgaricus bisporus DB42 DB42/T 672-2010 I 前 言本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 植 物 科 技 学 院 ， 农 业 部 微
2、生 物 产 品 质 量 监 督 检 验 测 试 中 心 （ 武 汉 ） ，湖 北 省 食 用 菌 工 程 技 术 研 究 中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 边 银 丙 、 王 卓 仁 、 樊 晓 琳 、 李 维 琳 、 叶 绿 笋 、 徐 章 逸 、 刘 丹 丹 。 DB42/T 672-2010 1 双 孢 蘑 菇 菌 种 提 纯 复 壮 技 术 规 程1 范 围本 标 准 规 定 了 双 孢 蘑 菇 菌 种 提 纯 复 壮 技 术 规 程 的 术 语 和 定 义 、 技 术 要 求 、 菌 种 提 纯 复 壮 方 法 、 菌 种质 量 的 评 价 和 提 纯 复 壮 结 果 的
3、 判 定 。本 标 准 适 用 于 湖 北 省 棚 室 层 架 栽 培 和 露 地 栽 培 双 孢 蘑 菇 的 菌 种 提 纯 复 壮 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB/T 12728-2006 食 用 菌 术 语GB 19171 双 孢 蘑 菇 菌 种NY 5099 无 公 害 食 品
4、食 用 菌 栽 培 基 质 安 全 技 术 要 求NY/T 5333-2006 无 公 害 食 品 食 用 菌 生 产 技 术 规 范 食 用 菌 菌 种 管 理 办 法 （ 2006年 3月 27日 农 业 部 令 第 62号 公 布 ）3 术 语 和 定 义GB/T12728-2006 中 界 定 的 以 及 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 ， 为 了 便 于 使 用 ， 以 下 重 复 列 出 了GB/T12728-2006 中 的 某 些 术 语 和 定 义 。3.1 菌 种 纯 度 culture purity指 某 一 菌 种 只 含 有 特 定 品 种 的 菌
5、 丝 体 。3.2 菌 种 活 力 culture vigour菌 种 活 力 包 括 萌 发 能 力 、 定 植 能 力 和 吃 料 能 力 。3.3 待 检 菌 种 tested culture指 由 委 托 方 提 供 的 需 要 判 定 是 否 提 纯 复 壮 的 菌 种 。3.4 标 准 菌 种 standard culture 指 由 法 定 菌 种 保 藏 机 构 进 行 科 学 保 藏 的 、 菌 种 来 源 明 确 且 种 性 稳 定 、 活 力 正 常 的 菌 种 ， 包 括 标 准 母种 （ 一 级 菌 种 ） 、 标 准 原 种 （ 二 级 菌 种 ） 和 标 准 栽
6、培 种 （ 三 级 菌 种 ） 。 DB42/T 672-2010 2 3.5 菌 种 退 化 culture degeneration菌 种 在 生 长 和 栽 培 过 程 中 ， 由 于 遗 传 变 异 导 致 优 良 性 状 下 降 。3.6 菌 种 提 纯 culture purification使 菌 种 得 到 进 一 步 纯 化 ， 并 保 持 菌 种 优 良 性 状 的 技 术 措 施 。3.7 菌 种 复 壮 culture rejuvenation良 种 繁 育 中 防 止 菌 种 退 化 的 技 术 措 施 。3.8 复 壮 菌 种 rejuvenated culture
7、通 过 一 定 的 技 术 措 施 恢 复 了 原 有 优 良 性 状 的 菌 种4 技 术 要 求4.1 检 验 场 地 选 择检 验 场 地 所 处 的 环 境 应 不 影 响 检 验 结 果 的 有 效 性 或 不 对 其 所 要 求 的 测 量 准 确 度 产 生 不 利 的 影 响 。 检验 场 地 的 检 验 工 作 区 域 、 能 源 、 采 光 、 控 温 、 通 风 等 应 该 保 证 有 利 于 正 常 检 验 工 作 的 进 行 。4.1.1 显 微 镜 观 察 室显 微 镜 观 察 室 应 干 燥 、 通 风 、 环 境 卫 生 洁 净 。 显 微 镜 所 在 试 验
8、台 有 局 部 照 明 ， 远 离 水 源 。4.1.2 微 生 物 培 养 室微 生 物 培 养 室 内 保 证 干 燥 、 通 风 ， 具 有 紫 外 灯 等 消 毒 条 件 ， 能 采 取 适 当 措 施 与 外 间 安 全 隔 离 。 产 孢 培 养 物 应 密 闭 培 养 ， 以 防 止 孢 子 飞 散 。4.2 栽 培 场 所 和 栽 培 基 质 要 求栽 培 场 所 应 符 合 NY/T 5333-2006 的 要 求 。 栽 培 基 质 应 符 合 NY 5099 的 要 求 。5 菌 种 提 纯 复 壮 方 法5.1 子 实 体 组 织 分 离 法5.1.1 选 取 形 态
9、具 有 该 品 种 典 型 特 征 、 六 、 七 分 成 熟 、 无 病 斑 、 无 虫 蛀 、 无 污 损 的 子 实 体 ；5.1.2 在 无 菌 条 件 下 ， 用 无 菌 水 将 子 实 体 表 面 反 复 冲 洗 干 净 ， 用 解 剖 刀 在 菌 盖 和 菌 柄 中 部 纵 切 ， 挑 取菌 柄 与 菌 盖 交 接 处 的 小 块 菌 髓 ， 转 入 PDA 斜 面 培 养 基 ， 于 25 条 件 下 培 养 ， 供 制 备 一 级 菌 种 用 。5.2 菌 丝 尖 端 分 离 法 无 菌 操 作 条 件 下 ， 在 双 目 放 大 镜 下 挑 取 菌 落 上 菌 丝 尖 端
10、约 5mm 长 度 的 单 根 菌 丝 ， 转 至 PDA 斜 面培 养 基 中 培 养 ， 供 制 备 一 级 菌 种 。5.3 原 生 质 体 再 生 法 DB42/T 672-2010 3 5.3.1 收 集 培 养 7-10d 的 幼 嫩 菌 丝 ， 采 用 2.0%溶 壁 酶 （ Lywallzyme） 和 7.0%蜗 牛 酶 （ Snailase） 的 混合 酶 液 进 行 酶 解 ， 获 取 原 生 质 体 混 合 液 ； 将 原 生 质 体 混 合 液 过 滤 、 离 心 ， 采 用 0.6M 甘 露 醇 等 渗 液 洗 涤两 次 ；5.3.2 吸 取 适 量 的 原 生 质
11、体 稀 释 液 ， 均 匀 涂 布 到 附 录 A.1 中 的 再 生 培 养 基 平 板 上 ， 于 25 条 件 下 进 行恒 温 培 养 ；5.3.3 挑 取 再 生 培 养 基 上 出 现 的 星 芒 状 微 小 菌 落 ， 转 移 到 附 录 A.2 中 PDPY 培 养 基 的 斜 面 培 养 基 中 培养 ， 供 制 备 一 级 菌 种 用 。6 菌 种 制 作按 照 GB 19171 的 方 法 制 作 。7 菌 种 种 性 评 价 7.1 菌 种 种 性 质 量 要 求7.1.1 感 官 特 性应 符 合 GB 19171 的 质 量 要 求 。7.1.2 生 物 学 特 性
12、 表 1 菌 种 生 物 学 特 性 的 质 量 要 求项 目 质 量 要 求母 种 菌 丝 生 长 速 度 应 符 合 GB 19171 的 质 量 要 求原 种 、 栽 培 种 菌 丝 生 长 速 度 应 符 合 GB 19171 的 质 量 要 求 菌 丝 生 长 温 度 范 围 应 符 合 双 孢 蘑 菇 (530) 的 温 度 范 围 要 求 ， 待 检菌 种 和 标 准 菌 种 相 差 不 应 超 过 2菌 丝 生 长 最 适 生 长 温 度 应 符 合 双 孢 蘑 菇 (241) 的 温 度 范 围 要 求 ， 待 检菌 种 和 标 准 菌 种 相 差 不 应 超 过 2菌 丝
13、生 长 最 适 pH 值 应 符 合 双 孢 蘑 菇 pH6.57.0 的 pH 范 围 要 求 ， 待检 菌 种 和 标 准 菌 种 最 适 pH 相 差 不 应 超 过 0.57.1.3 农 艺 性 状 表 2 菌 种 农 艺 性 状 的 质 量 要 求 项 目 质 量 要 求菌 种 萌 发 定 植 能 力 母 种 、 原 种 转 接 及 栽 培 种 播 种 后 应 在 24h 之 内 萌发 定 植 DB42/T 672-2010 4 表 2（ 续 ） 菌 种 农 艺 性 状 的 质 量 要 求结 菇 转 潮 能 力 覆 土 厚 度 (3 4)cm,平 均 3.5cm;覆 土 后 (12
14、16)d开 始 出 菇 ， (18 22)d 开 始 采 收 ， 每 潮 间 隔 (7 10)d生 物 学 效 率 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 的 差 异 值 不 超 过 5%第 1 潮 和 第 2 潮 菇 的 产 量 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 之 间 不 存 在 显 著 性 差 异菇 形 、 质 地 、 色 泽 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 没 有 明 显 差 异菇 盖 直 径 和 厚 度 、 菇 柄 长 度 和 直 径 ； 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 之 间 不 存 在 显 著 性 差 异7.2 菌 种 种 性 的 评 价 方 法 7.2.1 感 官 检 验
15、7.2.1.1 肉 眼 观 察按 照 GB 19171 的 方 法 ， 肉 眼 观 察 菌 种 外 观 和 容 器 。7.2.1.2 鼻 嗅按 照 GB 19171 的 方 法 ， 用 鼻 子 嗅 菌 种 是 否 有 酸 臭 、 霉 等 异 味 。7.2.1.3 菌 丝 显 微 观 察在 载 玻 片 上 滴 一 滴 无 菌 水 ， 用 解 剖 针 挑 取 待 检 菌 株 少 许 活 化 的 菌 丝 于 水 滴 上 ， 盖 上 盖 玻 片 。 先 用10 倍 物 镜 观 察 ， 再 转 到 40 倍 物 镜 下 观 察 菌 丝 的 形 态 结 构 ， 测 量 菌 丝 细 胞 的 宽 度 ， 同
16、时 与 标 准 菌 种 比 较 ，观 察 两 者 在 菌 丝 直 径 、 分 支 密 度 、 分 枝 特 征 等 方 面 有 无 明 显 差 异 。 观 察 不 少 于 50 个 不 同 视 野 。7.2.2 生 物 学 特 性 检 验7.2.2.1 菌 丝 生 长 速 度按 照 GB 19171 中 的 检 测 方 法 进 行 。7.2.2.2 温 度 将 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 进 行 活 化 ， 将 直 径 约 5mm 的 接 种 块 接 种 到 附 录 A.3 的 母 种 PDA 培 养 基 平 皿中 （ 直 径 90mm） ， 分 别 在 5 、 10 、 15 、 18
17、 、 20 、 22 、 24 、 26 、 28 、 30 、 32 、34 、 36 下 培 养 ， 观 察 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 在 相 同 温 度 下 的 生 长 速 度 。7.2.2.3 pH值取 待 检 菌 种 活 化 的 菌 丝 块 接 入 于 不 同 酸 碱 度 (pH411)的 平 板 培 养 基 上 ， 置 于 适 宜 的 温 度 下 培 养 。 当菌 落 直 径 达 1cm2cm 时 ， 在 菌 落 边 缘 画 线 作 为 生 长 起 始 线 ， 继 续 培 养 。 当 菌 丝 快 长 满 皿 时 ， 再 画 一 条终 止 线 。 测 量 起 始 线 与 终
18、 止 线 之 间 的 距 离 ， 计 算 菌 丝 生 长 速 度 ， 获 得 菌 丝 生 长 适 宜 的 pH 范 围 和 最 适 pH值 。7.2.3 农 艺 性 状 检 测7.2.3. 菌 种 萌 发 定 植 能 力 检 测将 待 检 菌 转 接 到 附 录 A.3、 附 录 A.4 和 附 录 A.5 的 培 养 基 (料 )中 ， (24 2) 培 养 ， 肉 眼 观 察 菌 丝 的萌 发 定 植 情 况 。7.2.3.2 子 实 体 形 态 观 察 将 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 制 种 ， 在 附 录 A.5 的 培 养 料 中 进 行 出 菇 试 验 。 按 常 规 方
19、法 栽 培 出 菇 后 进 行 子实 体 形 态 观 察 。7.2.3.3 结 菇 转 潮 能 力将 待 检 菌 种 与 标 准 菌 种 制 种 ， 在 附 录 A.5 的 培 养 料 中 进 行 出 菇 试 验 。 覆 土 厚 度 3cm 4cm， 观 察 覆土 后 的 出 菇 时 间 、 采 收 时 间 和 转 潮 间 隔 时 间 。 DB42/T 672-2010 5 7.2.3.4 产 量 性 状制 作 待 检 菌 种 和 标 准 菌 种 的 三 级 菌 种 ， 按 照 附 录 A.5 中 的 培 养 料 配 方 制 作 栽 培 料 进 行 栽 培 试 验 ， 试验 采 用 随 机 区
20、 组 排 列 ， 不 少 于 3 次 重 复 ， 每 小 区 不 少 于 3 平 方 米 ， 设 保 护 区 和 保 护 行 。 统 计 待 检 待 检 菌种 与 标 准 菌 种 的 单 位 面 积 产 量 ， 进 行 差 异 显 著 性 检 验 。7.2.3.5 生 物 学 效 率统 计 第 一 潮 菇 、 第 二 潮 菇 、 第 三 潮 菇 和 第 四 潮 菇 的 鲜 重 ， 分 别 计 算 待 检 菌 种 和 标 准 菌 种 的 生 物 学 效率 ， 再 比 较 两 者 生 物 学 效 率 的 差 异 。8 菌 种 活 力 评 价8.1 菌 种 活 力 的 质 量 要 求8.1.1 菌
21、丝 萌 发 定 植 能 力 菌 丝 应 在 24h 以 内 萌 发 定 植 。8.1.2 菌 丝 生 长 速 度应 符 合 GB 19171的 质 量 要 求 。8.2 菌 种 活 力 评 价 方 法8.2.1 菌 丝 萌 发 能 力按 无 菌 操 作 要 求 ， 挑 取 小 块 待 检 菌 种 的 菌 丝 块 ， 转 接 到 PDA 培 养 基 平 板 (或 斜 面 )培 养 基 上 ， 置 于 (24 2) 的 温 度 下 培 养 ， 观 察 其 萌 发 出 新 菌 丝 的 能 力 。8.2.2 菌 丝 生 长 速 度按 照 GB 19171 规 定 的 方 法 进 行 检 验 。9 菌
22、种 纯 度 评 价 9.1 菌 种 纯 度 质 量 要 求应 符 合 GB 19171 规 定 的 质 量 要 求 。9.2 菌 种 纯 度 评 价 方 法9.2.1 肉 眼 观 察在 光 线 适 宜 的 条 件 下 ， 肉 眼 观 察 装 有 菌 种 的 容 器 中 是 否 混 有 细 菌 、 霉 菌 、 螨 虫 、 线 虫 等 其 它 生 物 及其 代 谢 物 。9.2.2 细 菌 和 霉 菌 的 检 测按 照 GB 19171 规 定 的 方 法 进 行 检 测 。9.2.3 螨 虫 和 线 虫 检 测用 接 种 针 挑 取 取 少 许 待 检 菌 种 的 菌 丝 于 载 玻 片 上 水
23、 滴 中 ， 盖 上 盖 玻 片 ， 用 10 倍 或 40 倍 物 镜 观 察 不少 于 50 个 视 野 ， 检 查 是 否 有 螨 虫 或 线 虫 存 在 。 10 待 检 菌 种 提 纯 复 壮 试 验 结 果 的 判 定菌 种 质 量 的 判 定 按 菌 种 种 性 、 菌 种 纯 度 和 菌 种 活 力 的 质 量 要 求 进 行 。 待 检 菌 种 全 部 检 验 项 目 与 标 准菌 种 没 有 显 著 差 别 ， 或 者 优 于 标 准 菌 种 时 ， 则 判 定 其 为 提 纯 复 壮 菌 种 。 DB42/T 672-2010 6 附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）培
24、养 基 配 方A.1 原 生 质 体 再 生 培 养 基 配 方葡 萄 糖 20g， 蛋 白 胨 2g， 麦 芽 浸 膏 2g， MgSO4.7H2O 0.5g， K2HPO4 0.46g， 维 生 素 B1 20mg， 琼 脂15g， 以 0.6M 甘 露 醇 作 为 渗 透 压 稳 定 剂 ， 加 蒸 馏 水 定 容 至 1L。A.2 PDPY培 养 基 配 方马 铃 薯 200g， 葡 萄 糖 20g， 蛋 白 胨 1g， 酵 母 膏 1g， 琼 脂 20g， 加 蒸 馏 水 定 容 至 1L。A.3 母 种 PDA培 养 基 配 方 马 铃 薯 200 g(用 浸 出 汁 )， 葡 萄 糖 20g， 琼 脂 20g， 水 1000mL， pH 自 然 。A.4 双 孢 蘑 菇 原 种 、 栽 培 种 培 养 基 配 方谷 粒 98%， 石 膏 粉 2%， 含 水 量 50%士 1%， pH 自 然 。A.5 双 孢 蘑 菇 腐 熟 粪 草 栽 培 培 养 料 配 方腐 熟 牛 粪 粉 （ 干 ） 20%， 腐 熟 稻 草 秆 （ 干 ） 77%， 石 膏 1%， 碳 酸 钙 2%， 含 水 量 62 土 1%， pH7.5。_
