1、ICS 11.220B 41备 案 号 ： DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 795 2012禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 检 测 方 法 Method of the latex agglutination for the detection of avian influenza virus 2012 -01- 06发 布 2012 -03- 01实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 7952012 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 术 语 和 定 义 .13 实 验 原 理 .1 4 实 验 条 件 .15 实 验
2、材 料 .16 样 品 处 理 .27 实 验 方 法 .28 结 果 判 定 .29 注 意 事 项 .3附 录 A.4 DB42/T 7952012 II 前 言本 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院 、 武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司 、 湖 北 省 动 物 疫病 预 防
3、 控 制 中 心 。本 标 准 起 草 人 ： 金 梅 林 、 钟 广 汉 、 但 汉 并 、 郭 学 波 、 徐 高 原 、 张 安 定 、 周 艳 君 、 孙 小 美 、 李 淑 云 。 DB42/T 7952012 III 引 言禽 流 感 病 毒 （ Avian Influenza Virus, AIV） 具 有 易 变 异 的 特 点 ， 可 通 过 突 变 获 得 对 人 的 感 染 和 致 病能 力 ， 导 致 重 大 的 公 共 卫 生 危 害 。 为 加 强 禽 流 感 监 测 ， 制 定 了 禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 试 验 检 测 方 法 ，本 方 法 具 有
4、简 便 、 快 速 的 优 点 ， 尤 其 适 合 基 层 现 场 使 用 。本 文 件 的 发 布 机 构 提 请 注 意 ， 声 明 符 合 本 文 件 时 ， 可 能 涉 及 到 一 种 禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 检 测 试 剂盒 及 应 用 （ 专 利 号 ： ZL200510019512.3） 相 关 的 专 利 的 使 用 。本 文 件 的 发 布 机 构 对 于 该 专 利 的 真 实 性 、 有 效 性 和 范 围 无 任 何 立 场 。该 专 利 持 有 人 已 向 本 文 件 的 发 布 机 构 保 证 ， 他 愿 意 同 任 何 申 请 人 在 合 理 且 无
5、歧 视 的 条 款 和 条 件 下 ，就 专 利 授 权 许 可 进 行 谈 判 。 该 专 利 持 有 人 的 声 明 已 在 本 文 件 的 发 布 机 构 备 案 。 相 关 信 息 可 以 通 过 以 下 联系 方 式 获 得 ： 专 利 持 有 人 姓 名 ： 金 梅 林 、 陈 剑 锋 、 喻 正 军 、 张 安 定 、 李 红 超 、 陈 焕 春 。地 址 ： 武 汉 市 洪 山 区 狮 子 山 街 1号 华 中 农 业 大 学邮 政 编 码 ： 430070联 系 电 话 ： 027-87282608传 真 ： 027-87282608请 注 意 除 上 述 专 利 外 ， 本
6、 文 件 的 某 些 内 容 仍 可 能 涉 及 其 他 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些专 利 的 责 任 。 DB42/T 7952012 1 禽 流 感 病 毒 乳 胶 凝 集 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 禽 流 感 病 毒 的 乳 胶 凝 集 试 验 检 测 方 法 的 术 语 和 定 义 、 实 验 原 理 、 实 验 条 件 、 实 验 材 料 、样 品 处 理 、 实 验 方 法 、 结 果 判 定 和 注 意 事 项 等 。本 标 准 适 用 于 禽 类 咽 /鼻 拭 子 、 肛 拭 子 、 内 脏 组 织 、 鸡 胚
7、尿 囊 液 、 细 胞 培 养 物 中 禽 流 感 病 毒 的 检 测 。2 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。乳 胶 （ Latex） ： 聚 合 物 微 粒 分 散 于 水 中 形 成 的 胶 体 乳 液 。 3 实 验 原 理禽 流 感 病 毒 核 蛋 白 的 多 克 隆 抗 体 致 敏 固 相 载 体 羧 化 聚 苯 乙 烯 微 球 ， 当 与 相 应 的 抗 原 反 应 时 ， 可 形 成肉 眼 可 见 的 凝 集 颗 粒 。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温 （ 18 25 ） 进 行 。4.2 仪 器台 式 低
8、 温 高 速 离 心 机 、 微 量 移 液 器 、 冰 箱 、 玻 片 、 吸 头 。 4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护 。5 实 验 材 料5.1 乳 胶 诊 断 液5.2 阳 性 对 照含 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液 灭 活 处 理 。5.3 阴 性 对 照未 接 种 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液 。 DB42/T 7952012 2 5.4 样 品 处 理 液 A配 制 见 附 录 第 A.1章5.5 样 品 处 理 液 B配 制 见 附 录 第 A.2章6 样 品 处 理6.1 咽 /鼻 拭 子 和 肛 拭 子用 无 菌 棉 拭
9、子 于 禽 的 咽 喉 或 鼻 腔 、 泄 殖 腔 中 沾 取 渗 出 液 ， 然 后 浸 泡 于 1 mL 样 品 处 理 液 B 中 ， 剧 烈震 荡 1 min 后 挤 出 棉 拭 子 中 的 液 体 ， 冻 融 3 次 后 于 37 感 作 15 min， 置 2 8 ， 12,000 r/min 离心 5 min， 取 上 清 。 6.2 内 脏 组 织剪 取 组 织 块 0.5 g， 置 于 研 磨 器 中 ， 加 样 品 处 理 液 A 1 mL， 研 磨 后 取 出 组 织 浸 出 液 ， 冻 融 3 次 ， 然后 于 2 8 ， 12,000 r/min 离 心 15 min
10、， 取 上 清 。6.3 鸡 胚 尿 囊 液鸡 胚 尿 囊 液 样 品 ， 12,000 r/min 离 心 5 min， 取 上 清 。6.4 细 胞 培 养 物细 胞 培 养 物 可 直 接 用 于 检 测 或 者 冻 融 一 次 后 检 测 。7 实 验 方 法 取 样 品 、 阳 性 对 照 、 阴 性 对 照 各 8 L 10 L， 分 置 于 黑 色 背 景 的 玻 璃 片 上 。 各 加 等 量 的 乳 胶 试 剂 ，用 纤 细 洁 净 物 （ 牙 签 等 ） 搅 匀 ， 使 液 面 直 径 达 到 1.5 cm 左 右 ， 前 后 左 右 缓 慢 连 续 摇 动 30 sec，
11、 并 在 1 min内 观 察 记 录 结 果 。8 结 果 判 定8.1 凝 集 反 应 可 能 出 现 以 下 几 种 结 果 ：a） “ +” 全 部 胶 乳 凝 集 ， 颗 粒 聚 于 液 滴 边 缘 ， 液 体 完 全 透 明 ；b） “ +” 大 部 分 胶 乳 凝 集 ， 颗 粒 明 显 ， 液 体 稍 混 浊 ；c） “ +” 约 50 胶 乳 凝 集 ， 但 颗 粒 较 细 ， 液 体 较 混 浊 ；d） “ ” 有 少 许 凝 集 ， 液 体 呈 混 浊 ：e） “ ” 液 滴 呈 原 有 的 均 匀 乳 状 。 8.2 成 立 条 件30 sec 60 sec 内 出 现
12、 如 下 结 果 ， 试 验 方 可 成 立 ： 阳 性 对 照 样 品 与 乳 胶 诊 断 液 进 行 乳 胶 凝 集 反 应 ，应 出 现 “ +” 以 上 凝 集 ； 阴 性 对 照 样 品 与 乳 胶 诊 断 液 进 行 乳 胶 凝 集 反 应 ， 应 不 凝 集 。 DB42/T 7952012 3 8.3 结 果 判 断30 sec 60 sec 内 出 现 “ +” 以 上 凝 集 ， 判 为 阳 性 ； 30 sec 60 sec 内 液 滴 呈 原 有 的 均 匀 乳 状 为 阴 性 。9 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护
13、措 施 ， 废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理 。 DB42/T 7952012 4 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）试 剂 的 配 制A.1 样 品 处 理 液 A四 硼 酸 钠 （ Na 2B4O710H2O） 13.3 g硼 酸 （ H3BO3） 16.08 g氯 化 钠 （ NaCl） 8.5 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 800 mL， 调 pH值 至 8.4后 定 容 至 1000 mL。 置 2 8 下 保 存 备 用 。A.2 样 品 处 理 液 BN-乙 酰 -L-半 胱 氨 酸 5 gNP-40 5 mL加 1000 mL经 121 高 压 蒸 汽 灭 菌 30 min 的 样 品 处 理 液 A。 置 2 8 下 保 存 备 用 。_
