1、ICS 11.220B 41备 案 号 ： DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 788 2012猪 流 感 病 毒 (H1亚 型 )酶 联 免 疫 吸 附 试 验 抗体 检 测 方 法 Method of the Enzyme-linked immunosobent assay for the detection of antibodiesagainst swine influenza virus (subtype H1) 2012 -01- 06发 布 2012 -03- 01实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 7882012 I 目 次前 言 .
2、II引 言 .III1 范 围 .12 缩 略 词 .13 实 验 原 理 .1 4 实 验 条 件 .15 实 验 材 料 .16 实 验 方 法 .27 结 果 判 定 .38 注 意 事 项 .3附 录 A.4 DB42/T 7882012 II 前 言本 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院 、 武 汉
3、 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司 、 湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 郭 学 波 、 杨 影 、 陈 焕 春 、 徐 高 原 、 钟 广 汉 、 宋 念 华 、 田 峰 、 董 晓 辉 、孙 小 美 、 李 淑 云 。 DB42/T 7882012 III 引 言猪 流 感 病 毒 (Swine Influenza Virus, SIV)属 正 粘 病 毒 科 ， 可 引 起 猪 流 行 性 感 冒 (Swine Influenza, SI)。在 猪 群 中 广 泛 流 行 的 SIV 主 要 是
4、古 典 型 H1N1 和 类 禽 型 H1N1， 可 引 起 猪 咳 嗽 、 呼 吸 困 难 、 发 热 和 衰 竭等 症 状 易 暴 发 流 行 。 由 于 SIV 对 呼 吸 道 上 皮 的 高 度 特 异 亲 嗜 性 而 使 呼 吸 道 管 壁 上 皮 受 损 ， 导 致 猪 链 球菌 、 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 、 副 猪 嗜 血 杆 菌 、 巴 氏 杆 菌 等 细 菌 和 猪 呼 吸 道 冠 状 病 毒 、 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病毒 等 的 继 发 或 混 合 感 染 ， 使 病 情 更 为 复 杂 。 为 开 展 猪 流 感 的 免 疫 监 测 ， 了 解
5、猪 群 猪 流 感 病 毒 抗 体 水 平 ，指 导 猪 流 感 免 疫 预 防 工 作 ， 特 制 定 本 标 准 。 DB42/T 7882012 1 猪 流 感 病 毒 (H1 亚 型 )酶 联 免 疫 吸 附 试 验 抗 体 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 猪 流 感 病 毒 (H1 亚 型 ) 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 抗 体 检 测 方 法 的 缩 略 词 、 实 验 原 理 、 实 验 条件 、 实 验 材 料 、 实 验 方 法 、 结 果 判 定 和 注 意 事 项 等 。本 标 准 适 用 于 猪 血 清 中 的 流 感 病 毒 抗 体 的 检 测 。
6、2 缩 略 词下 列 缩 略 词 适 用 于 本 文 件 。ELISA（ enzyme-linked immunosorbent assay） ： 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 OD630nm值 ： 630 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值HRP： 辣 根 过 氧 化 物 酶HI 法 ： 血 凝 抑 制 试 验 法S： 样 品 孔 OD630nm值P： 阳 性 对 照 孔 OD630nm平 均 值3 实 验 原 理应 用 酶 联 免 疫 原 理 制 成 检 测 猪 流 感 病 毒 （ H1 亚 型 ） 抗 体 的 间 接 ELISA 方 法 。 利 用 抗 原 抗 体 反 应 的特 异 性
7、 ， 将 特 异 性 的 猪 流 感 病 毒 （ H1 亚 型 ） 抗 原 吸 附 到 固 相 载 体 的 表 面 后 ， 待 检 物 中 若 含 有 相 应 的 抗体 ， 则 可 与 所 包 被 的 抗 原 相 结 合 ， 并 能 进 一 步 和 酶 标 记 抗 体 结 合 形 成 复 合 物 。 在 遇 到 相 应 的 底 物 时 ， 复合 物 中 的 酶 能 催 化 底 物 发 生 显 色 反 应 。 其 显 色 的 深 浅 与 相 应 的 抗 体 量 成 正 相 关 ， 可 借 助 OD 630nm值 的 大小 进 行 定 性 判 断 。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操
8、作 宜 在 常 温 （ 18 25 ） 进 行 。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机 、 微 量 移 液 器 、 冰 箱 、 恒 温 箱 、 酶 标 仪 。4.3 人 员 注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护 。5 实 验 材 料 DB42/T 7882012 2 5.1 猪 流 感 病 毒 （ H1 亚 型 ） 抗 原 （ 见 附 录 A.8） 。5.2 酶 标 板 ： 96 孔 板 ， 可 拆 。5.3 酶 标 记 抗 体 （ 见 附 录 A.9） 。5.4 阳 性 对 照 血 清 （ 见 附 录 A.10） 。5.5 阴 性 对 照 血 清 （ 见 附 录 A.11）
9、 。5.6 其 它 试 剂包 被 液 、 封 闭 液 、 洗 涤 液 、 样 品 稀 释 液 、 底 物 液 A、 底 物 液 B、 终 止 液 。 试 剂 配 方 及 要 求 见 附 录A。6 实 验 方 法6.1 样 品 采 集 将 采 集 的 猪 全 血 静 置 30 min， 收 集 上 清 备 用 。6.2 抗 原 包 被 板 制 备取 猪 流 感 病 毒 （ H1 亚 型 ） 抗 原 用 包 被 液 稀 释 到 工 作 浓 度 （ 2.5 g/mL） ， 加 入 酶 标 板 ， 100 L/孔 ，37 孵 育 2 h。 弃 去 孔 中 液 体 ， 拍 干 。 加 入 封 闭 液 ，
10、 200 L/孔 ， 于 37 封 闭 2 h， 取 出 酶 标 板 弃 去 孔 中液 体 在 吸 水 纸 上 拍 干 ， 于 2 8 保 存 ， 可 保 存 7 d。6.3 样 品 稀 释在 血 清 稀 释 板 中 按 1:40 的 比 例 稀 释 样 品 （ 例 如 ： 195 L 样 品 稀 释 液 中 加 入 5 L 样 品 ， 即 为 1:40稀 释 ） 。 稀 释 好 的 样 品 可 在 2 8 保 存 7 d。6.4 加 样取 出 抗 原 包 被 板 （ 根 据 样 品 多 少 ， 可 拆 开 分 次 使 用 ） ， 先 用 洗 涤 液 洗 板 1 次 ， 再 将 稀 释 好 的
11、 样 品 取 加 入 抗 原 包 被 板 ， 100 L/孔 。 同 时 设 2 孔 阴 性 对 照 、 2 孔 阳 性 对 照 及 1 孔 空 白 对 照 ， 轻 轻 振 匀 孔 中 样 品（ 勿 溢 出 ） ， 置 37 下 孵 育 30 min。6.5 洗 涤取 出 抗 原 包 被 板 弃 去 孔 中 液 体 ， 在 吸 水 纸 上 拍 干 ， 用 洗 涤 液 洗 板 3 次 ， 200 L/孔 。 每 次 静 置 3 min后 倒 掉 液 体 ， 在 吸 水 纸 上 拍 干 。6.6 加 酶 标 记 抗 体取 酶 标 记 抗 体 用 样 品 稀 释 液 稀 释 到 工 作 浓 度 ，
12、加 入 酶 标 板 ， 100 L/孔 ， 37 孵 育 30 min。 按 6.5中 方 法 洗 板 3 次 。6.7 加 底 物 液每 孔 加 底 物 液 A 和 底 物 液 B 各 50 L， 混 匀 ， 置 室 温 下 （ 18 25 ） 避 光 显 色 10 min。 6.8 加 终 止 液每 孔 加 终 止 液 50 L， 轻 轻 振 荡 混 匀 。6.9 测 定 结 果 DB42/T 7882012 3 以 空 白 对 照 孔 调 零 ， 用 酶 标 仪 测 定 各 孔 的 OD630nm值 。 测 定 结 果 必 须 在 加 入 终 止 液 后 10 min 内 完 成 。7
13、结 果 判 定7.1 试 验 成 立 的 条 件 是 两 个 阳 性 对 照 孔 的 OD630nm值 相 差 应 0.3； 两 个 阳 性 对 照 孔 OD630nm值 均 应 0.8， 且 1.6。 两 个 阴 性 对 照 孔 OD630nm值 均 应 0.2。7.2 如 果 S 0.3， 判 为 阳 性 ； 如 果 S 0.3， 则 判 为 阴 性 。8 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施 ， 废 弃 物 应 做 无 害 化 处 理 。 DB42/T 7882012 4 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）试 剂 的 配 制A
14、.1 包 被 液 的 配 制碳 酸 钠 （ Na 2CO3） 1.59 g碳 酸 氢 钠 （ NaHCO3） 2.93 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL 即 可 ， 置 2 8 下 保 存 。A.2 封 闭 液 的 配 制5 g 牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 溶 于 1000 mL 洗 涤 液 。 置 2 8 下 保 存 。A.3 洗 涤 液 的 配 制氯 化 钠 （ NaCl） 8 g氯 化 钾 （ KCl ） 0.2 g 磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO412H2O） 2.9 g磷 酸 二 氢 钾 （ KH2PO4） 0.2 gTween-20
15、0.5 mL加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL 即 可 。 置 2 8 下 保 存 。A.4 样 品 稀 释 液 的 配 制牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） 5.0 g二 甲 基 亚 砜 （ DMSO） 10 mL加 洗 涤 定 容 至 1000 mL。 置 2 8 下 保 存 。A.5 底 物 液 A的 配 制 磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO4） 14.6 g柠 檬 酸 （ C6H8O7） 9.33 g过 氧 化 脲 （ CH6N2O3） 0.52 g加 蒸 馏 水 至 1000 mL用 盐 酸 调 pH值 至 5.0 5.4， 置 2 8 下 保 存
16、。A.6 底 物 液 B的 配 制四 甲 基 联 苯 胺 （ TMB） 20 mg无 水 乙 醇 （ C 2H6O） 10 mL DB42/T 7882012 5 加 蒸 馏 水 至 1000 mL置 2 8 下 避 光 保 存 。A.7 终 止 液 的 配 制40%的 氢 氟 酸 (HF) 625 L加 蒸 馏 水 至 100 mL置 2 8 下 保 存 。A.8 猪 流 感 病 毒 （ H1亚 型 ） 抗 原猪 流 感 病 毒 （ H1 亚 型 ） 抗 原 由 基 因 工 程 技 术 表 达 获 得 。 -20 下 保 存 备 用 。 A.9 酶 标 记 抗 体酶 标 记 抗 体 由 羊 抗 猪 I gG 经 HRP 标 记 获 得 。 2 8 下 保 存 备 用 。A.10 阳 性 对 照 血 清通 过 筛 选 猪 流 感 病 毒 （ H1 亚 型 ） 抗 体 阳 性 猪 获 得 ， 效 价 应 大 于 7l og2（ HI 法 ） 。 2 8 下 保存 备 用 。A.11 阴 性 对 照 血 清通 过 筛 选 猪 流 感 病 毒 （ H1 亚 型 ） 抗 体 阴 性 猪 获 得 ， 效 价 应 小 于 2l og2（ HI 法 ） 。 2 8 下 保存 备 用 。 _
