1、ICS 62.120 B 20 备案号： 33839-2012 DB42 湖北省 地 方 标 准 DB42/T 808 2012 饲料中黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、 赭曲霉毒素 A 和桔霉素的测定 高效液相色谱法 Determination of aflatoxin B1, zearalenone, ochratoxin A and citrinin in feed - HPLC method 2012 - 03 - 01 发布 2012 - 05 - 01 实施 湖北省质量技术监督局 发布 DB42/T 808 2012 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件
2、. 1 3 原理 . 1 4 试剂与材料 . 1 5 仪器与设备 . 2 6 采样 . 3 7 试样制备 . 3 8 分析步骤 . 3 8.1 提取与净化 . 3 8.2 测定 . 3 附录 A（资料性附录） 标准 工作液 色谱图 （四通道） . 5 图 A.1 黄曲霉毒素 B1 标准工作液的色谱图 . 5 图 A.2 玉米赤霉烯酮标准工作液的色谱图 . 5 图 A.3 赭曲霉毒素标准工作液的色谱图 . 5 图 A.4 桔霉素标准工作液的色谱图 . 5 附录 B（资料性附录） 标准 工作液 色谱图（ 程序波长 ） . 6 图 B.1 黄曲霉毒素 B1，玉米赤霉烯酮，赭曲霉毒素和桔霉素标准工作液
3、的色谱图 . 6 DB42/T 808 2012 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由湖北省 农业科学院 提出并归口 。 本标准起草单位 ：湖北省 农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所 、 华中农业大学 、 重庆市畜牧 科学院 。 本标准主要起草人：胡定金、周有祥、彭祥伟、李书谦、 王小红 、 陈建彪、路 磊、董丽娜、 夏 虹 、 解华东。 DB42/T 808 2012 1 饲料中黄曲霉毒素 B1、 玉米赤霉烯酮 、 赭曲霉毒素 A 和桔霉素的测定 高效液相色谱法 1
4、 范围 本标准规定了饲料中黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A和桔霉素的高效液相色谱测定的 原理、试剂与材料、仪器与设备、采样、试验制备及分析步骤。 本标准适用于 湖北省 畜禽配合饲料、饲用谷物原料中黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A 和桔霉素 的测定。 本标准的方法检测限：黄曲霉毒素 B1为 8 g/kg，玉米赤霉烯酮为 260 g/kg，赭曲霉毒素 A为 10 g/kg，桔霉素为 25 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于
5、本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试样中的黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯 酮、赭曲霉毒素 A和桔霉素，经乙腈 -水酸性溶液提取，浓缩至 干，以正己烷除杂，乙腈定容，通过带有荧光检测器的液相色谱系统分析，保留时间定性，外标法定量。 4 试剂与材料 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和 GB/T 6682中规定的二级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 磷酸： 85%（质量分数）。 4.3 冰乙酸。 4.4 正己烷。 4.5 无水硫酸镁。 4.6 氯化钠。 4.7 次氯酸
6、钠：化学纯。 4.8 黄曲霉毒素 B1 标准品：纯度 98%。 4.9 玉米赤霉烯酮 标准品：纯度 98%。 4.10 赭曲霉毒素 A 标准品：纯度 98%。 4.11 桔霉素标准品：纯度 98%。 DB42/T 808 2012 2 4.12 黄曲霉毒素 B1 标准 储备溶液： 准确称取适量的黄曲霉毒素 B1 标 准品（ 4.8），用乙腈（ 4.1）配 制成 1.010-2 g/L 的黄曲霉毒素 B1 标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。 4.13 玉米赤霉烯酮标准储备溶液：准确称取适量的玉米赤霉烯酮标准品（ 4.9），用乙腈（ 4.1）配制 成 5.010-2 g/L 的玉米赤霉烯酮标准储
7、备液，避光保存于 4冰箱备用。 4.14 赭曲霉毒素 A：准确称取适量的赭曲霉毒素 A 标准品（ 4.10），用乙腈（ 4.1）配制成 1.010-2 g/L 的赭曲霉毒素 A 标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。 4.15 桔霉素标准储备液：准确称取适量 的桔霉素标准品（ 4.11），用乙腈（ 4.1）配制成 5.010-2 g/L 的桔霉素标准储备液，避光保存于 4冰箱备用。 4.16 混合标准溶液工作液 取适量四种标准储备液至 10 mL容量瓶 （ 5.8） 中，加乙腈 （ 4.1） 稀释至刻度，现配现用 ，按照表 1 规定进行。 表 1 真菌毒素混合标准溶液 （ 单位为克每升 ） 项目
8、 名称 标准溶液 1 标准溶液 2 标准溶液 3 标准溶液 4 标准溶液 5 黄曲霉毒素 B1 5.010-5 1.010-4 1.510-4 2.010-4 4.010-4 玉米赤霉烯酮 5.010-4 1.010-3 1.510-3 2.010-3 4.010-3 赭曲霉毒素 A 5.010-5 1.010-4 1.510-4 2.010-4 4.010-4 桔霉素 2.510-4 5.010-4 7.510-4 1.010-3 2.010-3 注 1： 如需单独检测，可使用表 1 中的单一标准溶液。 注 2： 黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A 和桔霉素是有毒有害物质，测定时
9、应特别注意安全防护。测定 应在通风橱或者生物安全柜中进行并戴手套，尽量减少暴露。凡是接 触过毒素的物品，应用次氯酸钠溶液（ 4.20） 浸泡 1 小时以上；如皮肤接触到毒素，应 立即用次氯酸钠溶液清洗，再用自来水冲洗。 4.17 酸性提取液 吸取 12 mL冰乙酸 （ 4.3） ，以水定容至 100 mL，摇匀待用。 4.18 流动相 A 取 5 mL 磷酸（ 4.2）加入 1 000 mL 水中。临用前， 过 0.45 m滤膜 （ 5.12） 。 4.19 流动相 B 色谱纯 乙腈 （ 4.1） 。 4.20 次氯酸钠溶液 称取 106 g 次氯酸钠（ 4.7）溶解于 1 000 mL 水中
10、，其中有效氯含量不低于 5%。 5 仪器 与 设备 5.1 分析 天平，感量 0.000 1 g。 5.2 分样筛： 孔径 0.45 mm。 5.3 粉碎机。 5.4 漩涡混合器。 5.5 摇床。 5.6 旋转蒸发仪。 5.7 1 mL 可调 移液器 。 5.8 10 mL 棕色 容量瓶。 5.9 250 mL 圆底 磨口 烧瓶。 5.10 50 mL 具塞 PVC 离心管。 DB42/T 808 2012 3 5.11 2 mL 带盖 PVC 离心管。 5.12 0.45 m微孔滤膜 （适用于 水 溶剂）。 5.13 0.45 m微孔滤膜 （适用于有机溶剂）。 5.14 离心机，配有 50
11、mL 离心管适配器，最大转速为 4 000 r/min。 5.15 氮吹仪 。 5.16 高效液相色谱仪，配有荧光检测器。 6 采样 按照 GB/T 14699.1的规定执行。 7 试样制备 按照 GB/T 20195制备试样，磨碎 样品 并全部通过分样筛（ 5.2），充分 混匀，避光保存备用。 8 分析步骤 8.1 提取与净化 8.1.1 试样提取 称取 10 g试样（精确至 0.000 1 g），分装于 2个 50 mL离心管（ 5.10）中， 各 加入 15 mL酸性提取液（ 4.17）， 旋紧管盖， 在漩涡混合器（ 5.4）上 剧烈振荡 2 min，置于摇床 （ 5.5） 振摇 20
12、min。取出离心管，各管添 加 20 mL乙腈 （ 4.1） ， 再次 振摇 20 min，依次加入 2 g 氯化钠 （ 4.6） 和 3 g 无水硫酸镁 （ 4.5） ，迅速 旋紧管盖 ， 在漩涡混合器（ 5.4）上 剧烈振荡 2 min，以 3 500 r/min 离心 10 min，促使乙腈相和水相 分层， 并用移液器 （ 5.7） 取出 各管中的上层 乙腈层 ，合并 于 250 mL圆底 磨口烧瓶 （ 5.10） 中（操作时注意不 要取到水相） 。残留液再用 15 mL乙腈 （ 4.1）重复提取一次， 合并 后， 即为样品提取液。 8.1.2 试样浓缩和净化 将 上述 样品 提取液 置
13、于 40 下减压浓缩至干，加入 4 mL正己烷 （ 4.4） 和 1 mL乙腈 （ 4.1） 充分洗涤 残渣， 静置分层后， 用移液器 （ 5.7） 取出 上层正己烷，弃去。收集乙腈 提取液于 2 mL离心管 （ 5.11） 中，并用少量乙腈 （ 4.1） 重复洗涤残渣后， 合并乙腈 提取液，氮吹至近干，用乙 腈（ 4.1）准确 定容至 1 mL，在漩涡混合器（ 5.4）上混匀后，用 0.45 m 微孔滤膜 （ 5.13）过滤 ，待 测 。 8.2 测定 8.2.1 液相色谱参考条件 色谱柱： C18色谱柱 （长 250 mm，内径 4.6 mm，粒径 5 m）或相当者 ，推荐使用 Inert
14、sil ODS-3（ cat. NO 5020-04646） 1)； 柱 温： 30 ； 流 速： 0.8 mL/min； 进样量： 40 L； 流动相：流动相 A +流动相 B（ 50+50），体积比； 检测器条件：荧光检 测器 。 1) 色谱柱是由岛津 -GL(上海 )商贸有限公司提供的产品。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不代表对该 产品的认可。如果其他产品能有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 DB42/T 808 2012 4 多通道 荧光检测 器检测 参数如下： 黄 曲霉毒 素 B1：激发波长（ Ex） = 360 nm，发射波长（ Em） = 440 nm； 玉米赤霉烯酮
15、 ：激发波长（ Ex） = 274 nm，发射波长（ Em） = 440 nm； 赭曲霉毒素 A：激发波长（ Ex） = 333 nm，发射波长（ Em） = 477 nm； 桔霉素：激发波长（ Ex） = 330 nm，发射波长（ Em） = 500 nm。 荧光检测器程序波长参数如下： 0 10 min：激发波长（ Ex） = 360 nm，发射波长（ Em） = 440 nm； 1017 min：激发波长（ Ex） = 330 nm，发射波长（ Em） = 500 nm； 1719 min：激发波长（ Ex） = 333 nm，发射波长（ Em） = 477 nm； 1925 min：激
16、发波长（ Ex） = 274 nm，发射波长（ Em） = 440 nm。 8.2.2 标准曲线的绘制 向基线平稳的液相色谱分析仪连续注入各浓度 混合标准工作溶液，浓度由高到低，以峰面积 -浓度 作图，建立工作曲线。 8.2.3 定量测定 注入待测样液，各待测物的峰面积响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进 行分析。依据峰面积，从标准曲线中得到待测样液中待测物的浓度（ C），附录 A和附录 B给出了相关 色谱图。 8.2.4 结果计算 按式（ 1）计算试样中检测目标物的含量（ g/kg）： 0001 0001 mVCX . (1) 式中： X 试样中检测目标物的含量，以质量分
17、数表示，单位为微克每千克（ g/kg）； C 由标准曲线计算得到的上机试样溶液中目标物浓度，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； V 浓缩至干后试样的定容体积，单位为毫升（ mL）； m 试样的质量，单位为克（ g）。 平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。 8.2.5 精密度 同一实 验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于 15%。 DB42/T 808 2012 5 A A 附 录 A （资料性附录） 黄曲霉毒素 B1、桔霉素、赭曲霉毒素 A 和玉米赤霉烯酮色谱图（四通道荧光检测器） 图 A.1 黄曲霉毒素 B1 标准工作液的色谱图 （激发波长 =36
18、0 nm, 发射波长 =440 nm, 0.5 ng） 图 A.2 玉米赤霉烯酮标准工作液的色谱图 （ 激发波长 =274 nm, 发射波长 =440 nm, 125 ng） 图 A.3 赭曲霉毒素 A 标准工作液的色谱图 （激发波长 =333 nm, 发射波长 =477 nm, 0.5 ng） 图 A.4 桔霉素 标准工作液的色谱图 （激发波长 =330 nm, 发射波长 =500 nm, 12.5 ng） DB42/T 808 2012 6 B B 附 录 B （资料性附录） 黄曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素 A 和桔霉素色谱图（程序波长荧光检测器） 分钟 图 B.1 黄曲霉毒素 B1（ AFB1），玉米赤霉烯酮（ ZEN），赭曲霉毒素（ OTA）和桔霉素（ CIT） 标准工作液的色谱图 荧光检测器程序波长参数如下： 0 10 min： 激发波长（ Ex） = 360 nm，发射波长（ Em） = 440 nm； 1017 min： 激发波长（ Ex） = 330 nm，发射波长（ Em） = 500 nm； 1719 min： 激发波长（ Ex） = 333 nm，发射波长（ Em） = 477 nm； 1925 min： 激发波长（ Ex） = 274 nm，发射波长（ Em） = 440 nm。 _
