1、ICS 11.220B 41备 案 号 ： DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 791 2012禽 流 感 病 毒 ELISA检 测 方 法 Enzyme-linked immunosobent test for the detection of avian influenza virus 2012 -01- 06发 布 2012 -03- 01实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 7912012 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 缩 略 词 .13 实 验 原 理 .1 4 实 验 条 件 .15 实 验 材 料 .16 样
2、 品 处 理 .27 实 验 方 法 .28 结 果 判 定 .39 注 意 事 项 .3附 录 A.4 DB42/T 7912012 II 前 言本 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院 、 武 汉 科 前 动 物 生 物 制 品 有 限 责 任 公 司 、 湖 北 省 动 物 疫病 预 防 控 制 中 心
3、。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 金 梅 林 、 张 安 定 、 董 晓 辉 、 钟 广 汉 、 徐 高 原 、 陈 焕 春 、 郭 学 波 、 孙 小 美 、李 淑 云 、 周 艳 君 。 DB42/T 7912012 III 引 言高 致 病 性 禽 流 感 （ Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI） 是 严 重 威 胁 养 禽 业 发 展 的 烈 性 传 染 病 ，给 养 禽 业 造 成 了 巨 大 的 损 失 。 禽 流 感 病 毒 具 有 多 型 、 易 变 的 特 点 。 近 年 来 禽 流 感 病 毒 （ Avian Influenz
4、aVirus, AIV） 跨 越 了 中 间 宿 主 直 接 感 染 人 类 ， 对 公 共 卫 生 安 全 的 威 胁 引 起 了 广 泛 的 关 注 。本 标 准 规 定 了 禽 类 的 咽 /鼻 拭 子 、 肛 拭 子 、 内 脏 组 织 、 鸡 胚 尿 囊 液 、 细 胞 培 养 物 中 禽 流 感 病 毒 的 ELISA检 测 方 法 。 该 方 法 具 有 良 好 的 特 异 性 和 敏 感 性 ， 准 确 度 高 、 重 复 性 好 ， 适 用 于 临 床 大 量 样 品 的 快 速 检 测和 禽 流 感 诊 断 。 DB42/T 7912012 1 禽 流 感 病 毒 ELIS
5、A 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 禽 流 感 病 毒 ELISA 检 测 方 法 的 缩 略 词 、 实 验 原 理 、 实 验 条 件 、 实 验 材 料 、 样 品 处 理 、实 验 步 骤 、 结 果 判 定 和 注 意 事 项 等 。本 标 准 适 用 于 禽 类 咽 /鼻 拭 子 、 肛 拭 子 、 内 脏 组 织 、 鸡 胚 尿 囊 液 、 细 胞 培 养 物 中 禽 流 感 病 毒 的 检 测 。2 缩 略 词下 列 缩 略 词 适 用 于 本 标 准 。ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay):酶 联 免 疫 吸 附
6、试 验 OD630nm值 :630 纳 米 波 长 处 的 吸 光 值HRP:辣 根 过 氧 化 物 酶S:样 品 测 定 孔 OD630nm值3 实 验 原 理本 方 法 使 用 抗 禽 流 感 病 毒 核 蛋 白 的 单 克 隆 抗 体 包 被 固 相 载 体 酶 标 板 。 加 入 供 试 样 品 后 ， 如 果 样 品 中含 有 禽 流 感 病 毒 即 可 发 生 抗 原 抗 体 反 应 ， 再 加 入 兔 抗 禽 流 感 病 毒 的 多 克 隆 抗 体 ， 能 继 续 反 应 形 成 抗 原 抗体 复 合 物 ， 并 和 相 应 的 酶 结 合 物 结 合 ， 在 遇 到 相 应 的
7、 底 物 时 ， 复 合 物 中 的 酶 能 催 化 底 物 反 应 发 生 显 色 。其 显 色 的 深 浅 与 相 应 的 抗 体 量 成 正 比 ， 可 借 助 OD 630nm值 的 大 小 进 行 定 性 判 断 。4 实 验 条 件4.1 实 验 室实 验 操 作 宜 在 常 温 （ 18 25 ） 进 行 。4.2 仪 器台 式 低 温 高 速 离 心 机 、 微 量 移 液 器 、 冰 箱 、 恒 温 箱 、 酶 标 检 测 仪 。4.3 人 员注 意 个 人 防 护 和 环 境 保 护 。 5 实 验 材 料5.1 抗 禽 流 感 病 毒 单 克 隆 抗 体 。5.2 酶 标
8、 板 ： 96 孔 板 ， 可 拆 。5.3 兔 抗 禽 流 感 病 毒 的 多 克 隆 抗 体 ： 由 灭 活 的 禽 流 感 病 毒 免 疫 家 兔 制 备 。 DB42/T 7912012 2 5.4 酶 结 合 物 ： HRP 标 记 的 羊 抗 兔 抗 体 。5.5 阳 性 对 照 ： 含 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液 灭 活 处 理 。5.6 阴 性 对 照 ： 未 接 种 禽 流 感 病 毒 的 鸡 胚 尿 囊 液 。5.7 其 他 试 剂包 被 液 、 封 闭 液 、 洗 涤 液 、 样 品 处 理 液 A、 样 品 处 理 液 B、 底 物 液 A、 底 物 液
9、 B、 终 止 液 （ 见 附 录A）6 样 品 处 理6.1 咽 /鼻 拭 子 、 肛 拭 子用 无 菌 棉 拭 子 于 禽 的 咽 喉 或 鼻 腔 、 泄 殖 腔 中 沾 取 渗 出 液 ， 然 后 浸 泡 于 1 mL 样 品 处 理 液 B 中 ， 涡 旋仪 震 荡 1 min 后 挤 出 棉 拭 子 中 的 液 体 ， 冻 融 3 次 后 于 37 孵 育 15 min， 12,000 r/min 离 心 5 min， 取 上 清 。6.2 内 脏 组 织剪 取 组 织 块 约 1 g， 置 于 匀 浆 器 中 ， 加 入 1 mL 样 品 处 理 液 A 后 匀 浆 ， 冻 融 3
10、 次 后 ， 置 于 37 下15 min， 10,000 r/min 离 心 5 min， 取 上 清 。6.3 鸡 胚 尿 囊 液用 样 品 处 理 液 B 等 体 积 稀 释 后 ， 置 于 37 15min， 每 隔 3 min 5 min 混 匀 1 次 ， 10,000 r/min 离心 30 sec 60 sec， 取 上 清 。6.4 细 胞 培 养 物细 胞 培 养 物 可 直 接 用 于 检 测 或 者 冻 融 一 次 后 检 测 。 7 实 验 方 法7.1 抗 禽 流 感 病 毒 的 单 克 隆 抗 体 用 包 被 液 稀 释 到 工 作 浓 度 （ 5 g/mL） ，
11、 加 入 酶 标 板 ， 100 L/孔 ， 37孵 育 2 h。 加 入 封 闭 液 ， 200 L/孔 ， 于 37 封 闭 2 h， 取 出 酶 标 板 在 吸 水 纸 上 拍 干 ， 于 2 8 保存 备 用 。7.2 取 单 抗 包 被 板 ， 先 用 洗 涤 液 洗 板 1 次 ， 再 加 入 处 理 好 的 待 检 样 品 ， 100 L/孔 ； 加 入 阳 性 对 照 和 阴性 对 照 各 1 孔 ， 100 L/孔 ， 37 孵 育 30 min。7.3 取 出 单 抗 包 被 板 弃 去 孔 中 液 体 ， 在 吸 水 纸 上 拍 干 ， 用 洗 涤 液 洗 板 3 次 ，
12、 200 L/孔 。 每 次 静 置 3 min后 倒 掉 液 体 ， 在 吸 水 纸 上 拍 干 。7.4 将 兔 抗 禽 流 感 病 毒 的 多 克 隆 抗 体 稀 释 到 工 作 浓 度 （ 10 g/mL） ， 100 L/孔 ， 37 孵 育 30 min。7.5 重 复 7.3 操 作 步 骤 。7.6 加 入 酶 结 合 物 ， 100 L/孔 ， 37 孵 育 30 min。7.7 重 复 7.3 操 作 步 骤 。 7.8 加 入 底 物 液 A 和 底 物 液 B， 各 50 L/孔 ， 混 匀 ， 置 室 温 下 （ 18 25 ） 避 光 显 色 10 min。7.9
13、加 入 终 止 液 ， 50 L/孔 ， 混 匀 。7.10 用 酶 标 仪 测 定 各 孔 的 OD630nm值 ， 应 在 加 入 终 止 液 后 10 min 内 完 成 。8 结 果 判 定 DB42/T 7912012 3 8.1 ELISA 试 验 成 立 的 条 件 为 ： 阳 性 对 照 孔 OD630nm值 0.8； 阴 性 对 照 孔 OD630nm值 0.2。8.2 如 果 S 0.3， 判 为 阳 性 ； 如 果 S 0.3， 则 判 为 阴 性 。9 注 意 事 项实 验 过 程 中 注 意 做 好 个 人 的 生 物 安 全 防 护 措 施 ， 废 弃 物 应 做
14、无 害 化 处 理 。 DB42/T 7912012 4 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）试 剂 的 配 置A.1 包 被 液碳 酸 钠 （ Na 2CO3） 1.59 g碳 酸 氢 钠 （ NaHCO3） 2.93 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL 即 可 ， 置 2 8 保 存 备 用 。A.2 封 闭 液5 g 脱 脂 乳 溶 于 100 mL 洗 涤 液 。 置 2 8 保 存 备 用 。A.3 洗 涤 液氯 化 钠 （ NaCl） 8 g氯 化 钾 （ KCl ） 0.2 g磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO412H2O） 2.9 g磷 酸
15、 二 氢 钾 （ KH2PO4） 0.2 gTween-20 0.5 mL加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL 即 可 ， 置 2 8 保 存 备 用 。A.4 样 品 处 理 液 A四 硼 酸 钠 （ Na2B4O7 10H2O） 13.3 g硼 酸 （ H 3BO3） 16.08 g氯 化 钠 （ NaCl） 8.5 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 800 mL， 调 pH 值 至 8.4 后 定 容 至 1000 mL， 置 2 8 保 存 备 用 。A.5 样 品 处 理 液 BN-乙 酰 -L-半 胱 氨 酸 5 gNP-40 5 mL加 1000 m
16、L 经 121 高 压 蒸 汽 灭 菌 30 min 的 样 品 处 理 液 A， 置 2 8 保 存 备 用 。A.6 底 物 液 A磷 酸 氢 二 钠 （ Na 2HPO4） 14.6 g柠 檬 酸 9.33 g过 氧 化 氢 脲 0.52 g DB42/T 7912012 5 加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL， 调 至 pH 值 至 5.0 5.4， 置 2 8 保 存 备 用 。A.7 底 物 液 B磷 酸 氢 二 钠 （ Na2HPO412H2O） 14.2 g柠 檬 酸 10.5 g联 苯 二 胺 (TMB) 10 g加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL， 调 pH 值 至 5.0， 置 2 8 避 光 保 存 备 用 。A.8 终 止 液氢 氟 酸 （ HF） 6.25 mL， 加 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 定 容 至 1000 mL， 置 2 8 保 存 备 用 。 _
