1、ICS 11.220B 41备 案 号 ： 33857-2012 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 826 2012奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 MPO诊 断 方 法 The MPO diagnosis method of subclinical endometritis for dairy cow 2012-03-29发 布 2012-05-01实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 826 2012 I 目 次前 言 .II1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 缩 略 词 和 术 语 .14 原 理 .15 实 验 室 条
2、件 .16 临 床 症 状 .17 实 验 室 检 测 .27.1 样 品 采 集 .27.2 样 品 处 理 .2 7.3 检 测 步 骤 .27.4 结 果 计 算 .28 结 果 判 定 .2附 录 A（ 资 料 性 附 录 ） 髓 过 氧 化 物 酶 法 （ MPO） 灵 敏 度 、 准 确 性 、 临 床 验 证 .3附 录 B（ 资 料 性 附 录 ） MPO 与 PGF2 及 E2检 测 结 果 比 对 .4 DB42/T 826 2012 II 前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1 2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写
3、给 出 的 规 则 起 草 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 动 物 医 学 院 、 湖 北 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 郭 定 宗 、 尹 红 斌 、 杨 世 锦 、 周 东 海 、 李 家 奎 、 郭 锐 。 DB42/T 826 2012 III 引 言奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 是 在 子 宫 复 原 后 （ 产 后 8 周 后 ） ， 发 生 于 子 宫 内 膜 组 织 的
4、 一 种 慢 性 、 不 明 显 的子 宫 炎 性 过 程 。 因 为 其 病 理 分 泌 物 的 量 少 或 者 阙 如 ， 造 成 了 临 床 诊 断 和 治 疗 困 难 。 隐 性 子 宫 内 膜 炎 可 导致 母 牛 不 孕 症 ， 而 不 孕 症 引 起 产 犊 间 隔 延 长 、 繁 殖 率 降 低 、 产 奶 量 下 降 、 饲 养 成 本 增 高 ， 是 困 扰 奶 牛 产业 发 展 的 一 大 难 题 。 在 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 的 炎 症 反 应 中 ， 中 性 粒 细 胞 是 其 主 要 的 免 疫 细 胞 。 存 在 于 中性 粒 细 胞 的 髓 过 氧
5、 化 物 酶 （ MPO） 在 其 吞 噬 致 炎 因 子 过 程 中 被 释 放 于 子 宫 腔 内 。本 研 究 利 用 奶 牛 子 宫 回 收 液 中 髓 过 氧 化 物 酶 （ MPO） 的 含 量 与 隐 性 子 宫 内 膜 炎 有 极 强 的 相 关 性 ， 建立 了 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 MPO诊 断 方 法 ， 该 方 法 具 有 准 确 度 高 、 成 本 低 等 特 点 ， 便 于 基 层 推 广 使 用 。 DB42/T 826 2012 1 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 MPO诊 断 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 奶 牛 隐 性 子 宫 内
6、 膜 炎 髓 过 氧 化 物 酶 检 测 法 的 缩 略 语 、 原 理 、 测 定 方 法 、 结 果 判 定 等 。本 标 准 适 用 于 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 早 期 诊 断 、 监 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文件 。 凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通
7、 用 要 求 3 缩 略 词 和 术 语MPO 髓 过 氧 化 物 酶PMN 中 性 粒 细 胞PGF2 前 列 腺 素 2E2 雌 激 素OD 光 密 度呼 吸 爆 发 在 炎 症 过 程 中 ， 激 活 的 中 性 粒 细 胞 耗 氧 量 显 著 增 加 ， 产 生 大 量 氧 自 由 基 ， 又 称 为 氧 爆 发 。酶 活 力 单 位 每 mL 样 品 在 37 的 反 应 体 系 中 H 2O2被 分 解 1 mol为 一 个 酶 活 力 单 位 。4 原 理在 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 的 发 生 发 展 过 程 中 ， 存 在 于 中 性 粒 细 胞 中 的 髓 过 氧
8、 化 物 酶 （ MPO） 通 过 呼 吸爆 发 释 放 于 子 宫 中 ， 是 子 宫 内 膜 组 织 损 伤 的 主 要 标 识 物 。 利 用 奶 牛 子 宫 回 收 液 中 的 MPO含 量 与 隐 性 子 宫内 膜 炎 的 相 关 性 ， 以 MPO作 为 隐 性 子 宫 内 膜 炎 早 期 诊 断 的 特 异 性 因 子 ， 通 过 检 测 MPO浓 度 ， 诊 断 奶 牛 隐性 子 宫 内 膜 炎 。5 实 验 室 条 件5.1 本 实 验 应 在 生 物 安 全 BSL-1 实 验 室 进 行 ， 实 验 室 环 境 和 操 作 应 符 合 GB 19489 要 求 。5.2
9、实 验 室 应 配 备 MPO检 测 试 剂 盒 、 倒 置 相 差 显 微 镜 、 分 光 光 度 计 、 酶 标 仪 、 移 液 器 、 精 密 酸 度 计 、 超 低 温 冰 箱 等 器 材 。6 临 床 症 状奶 牛 生 产 后 8 周 发 情 屡 配 不 孕 ， 无 特 异 性 示 病 症 状 ， 疑 似 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 。 DB42/T 826 2012 2 7 实 验 室 检 测7.1 样 品 采 集掏 空 被 检 奶 牛 宿 粪 ， 用 5 %的 高 锰 酸 钾 溶 液 冲 洗 肛 门 部 及 外 阴 周 围 ， 用 75 %酒 精 棉 球 对 阴 道 边
10、缘 及内 侧 进 行 消 毒 ， 向 子 宫 内 注 入 20mL 灭 菌 生 理 盐 水 ， 直 肠 按 摩 子 宫 角 2min后 回 收 子 宫 液 5mL。 放 置 4保 存 ， 2h内 1200r/min、 5min离 心 ， 取 上 清 液 -70 保 存 。7.2 样 品 处 理7.2.1 将 样 品 用 MPO试 剂 盒 中 的 试 剂 2 制 备 成 5%的 组 织 匀 浆 10mL。7.2.2 将 上 述 组 织 匀 浆 用 MPO 试 剂 盒 中 的 试 剂 3 制 备 成 10%的 被 检 样 品 5mL， 充 分 混 匀 后 置 37 水 浴10min， 取 出 后
11、待 检 。7.3 检 测 步 骤 按 表 1步 骤 进 行 操 作 。 表 1 MPO检 验 步 骤步 骤 处 理 过 程 对 照 管 测 定 管第 1 步 蒸 馏 水 /mL 3.00第 2 步 样 本 /mL 0.20 0.20第 3 步 试 剂 4/mL 0.20 0.20第 4 步 显 色 剂 /mL 3.00 第 5 步 混 匀 ， 37 水 浴 30分 钟第 6 步 试 剂 7/mL 0.05 0.05第 7 步 混 匀 ， 60 水 浴 l0min， 取 出 后 用 酶 标 仪 检 测 OD460nm值 ， lcm光 径 ， 用 蒸 馏 水 调 零 。7.4结 果 计 算MPO
12、U /mL=(测 定 管 OD 值 对 照 管 OD值 )/11.3 取 样 量 (mL)8 结 果 判 定8.1 当 MPO的 活 力 单 位 3.2U/mL时 ， 判 定 为 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 阳 性 。8.2 当 MPO的 活 力 单 位 10%则 为 隐 性 子 宫 内 膜 炎 疑 似 奶 牛 ， 其 余 奶 牛 为 健 康 奶 牛 。 据 此筛 选 方 法 ， 从 实 验 对 象 中 选 出 80 头 疑 似 奶 牛 (I组 )， 80 头 健 康 奶 牛 ( 组 )， 进 行 了 髓 过 氧 化 物 酶 法 （ MPO）灵 敏 度 、 准 确 性 、 临 床 验
13、证 试 验 。 A.1 灵 敏 度选 用 细 胞 学 检 查 结 果 阳 性 奶 牛 和 阴 性 奶 牛 各 80 头 ， 共 计 160头 进 行 MPO 水 平 比 对 ， 如 表 2 所 示 ，疑 似 奶 牛 组 血 清 及 子 宫 回 收 液 MPO 水 平 均 高 于 健 康 奶 牛 组 。 其 中 子 宫 回 收 液 MPO 水 平 差 异 极 显 著(p0.01)， 血 清 样 品 差 异 显 著 (p0.05)。表 2 健 康 奶 牛 、 疑 似 奶 牛 血 液 及 子 宫 回 收 液 中 MPO水 平组 别 样 本 数 (头 ) MPO水 平 (U/mL)血 清 子 宫 回
14、收 液疑 似 奶 牛 80 3.08 0.12 a 4.38 0.08A健 康 奶 牛 80 1.92 0.07b 2.02 0.05BA.2 准 确 性对 MPO的 检 测 研 究 表 明 ， 疑 似 奶 牛 与 健 康 奶 牛 外 周 血 清 中 MPO 水 平 差 异 显 著 (p0.05)， 而 子 宫 回 收液 MPO水 平 差 异 极 显 著 (p0.01)。 疑 似 奶 牛 血 清 样 和 子 宫 回 收 液 的 MPO 水 平 均 高 于 健 康 奶 牛 组 。 结 果 表明 疑 似 奶 牛 的 MPO 可 以 作 为 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 早 期 诊 断 的 特
15、 异 因 子 ， 利 用 该 原 理 可 建 立 诊 断 方 法 。 本实 验 在 2U/mL 与 4U/mL之 间 设 置 了 20 个 不 同 的 阈 值 作 为 本 病 阳 性 判 定 点 ， 通 过 与 细 胞 学 检 查 结 果 进 行对 比 找 出 了 3.2U/mL为 最 佳 判 定 点 。 当 MPO 酶 活 力 单 位 为 3.2U/mL作 为 判 定 点 时 ， 隐 性 子 宫 内 膜 炎 阳 性头 数 为 78 头 ， 阴 性 头 数 为 82头 ， 其 中 阳 性 结 论 与 得 出 阳 性 符 合 率 为 97.5%， 阴 性 符 合 率 为 100%， 与 细胞 学
16、 诊 断 结 论 一 致 (见 表 3)。 表 3 本 检 测 法 与 细 胞 学 检 测 法 的 比 较 检 测 方 法 阳 性 奶 牛 （ 头 ） 阴 性 奶 牛 （ 头 ）细 胞 学 检 查 法 80 80MPO 法 78 82符 合 率 97.5% 100%A.3 临 床 验 证选 取 湖 北 地 区 共 三 个 奶 牛 场 MPO法 诊 断 为 隐 性 子 宫 内 膜 炎 阳 性 牛 52 头 ， 经 子 宫 灌 注 给 药 （ 头 孢 噻呋 2g/头 /d， 连 用 5d） ， 2个 发 情 期 后 48头 牛 受 孕 ， 受 孕 率 92.3%。 DB42/T 826 2012
17、4 附 录 B（ 资 料 性 附 录 ）MPO与 PGF2 及 E2检 测 结 果 比 对有 研 究 表 明 PGF2 具 有 溶 解 黄 体 和 免 疫 刺 激 性 ， 能 够 增 加 家 畜 子 宫 肌 层 的 收 缩 力 ， E2具 有 溶 解 黄体 ， 缩 短 空 怀 期 ， 提 高 奶 牛 受 孕 率 的 作 用 。 二 者 均 为 奶 牛 隐 性 子 宫 内 膜 炎 后 续 病 程 的 重 要 指 标 。本 实 验 表 明 隐 性 子 宫 内 膜 炎 疑 似 奶 牛 血 清 和 子 宫 回 收 液 中 PGF2 及 E2均 高 于 健 康 奶 牛 ， 但 是 两 者差 异 不 显
18、著 ， 不 能 为 诊 断 提 供 依 据 ， 而 疑 似 奶 牛 的 MPO 活 力 单 位 均 高 于 健 康 奶 牛 ， 结 果 提 示 MPO是 诊 断本 病 的 标 示 物 。 本 标 准 经 与 细 胞 学 检 查 结 果 比 对 ， 当 MPO活 力 单 位 为 3.2U/mL 作 为 判 定 点 时 ， 阳 性 符 合率 为 97.5%， 阴 性 符 合 率 为 100%（ 见 附 录 A2） 。B.1 健 康 奶 牛 、 疑 似 奶 牛 血 清 及 子 宫 回 收 液 中 PGF2 水 平对 采 集 的 血 清 样 和 子 宫 回 收 液 进 行 PGF2 水 平 检 测 结
19、 果 显 示 ， 疑 似 奶 牛 组 血 清 及 子 宫 回 收 液 PGF2 水 平 均 高 于 健 康 奶 牛 组 ， 但 差 异 不 显 著 （ P 0.05） 。 从 两 组 数 据 均 值 来 看 ， 血 清 样 中 PGF2 水平 均 高 于 子 宫 回 收 液 。 如 表 4 所 示 。表 4 健 康 奶 牛 、 疑 似 奶 牛 血 液 及 子 宫 回 收 液 中 PGF2 水 平组 别 样 本 数 (头 ) PGF2 (pg/mL)血 清 子 宫 回 收 液疑 似 奶 牛 80 105.97 18.46 75.97 19.76健 康 奶 牛 80 89.93 17.27 67.
20、93 18.27B.2 健 康 奶 牛 、 疑 似 奶 牛 血 液 及 子 宫 回 收 液 中 E2 水 平对 采 集 的 血 清 样 和 子 宫 回 收 液 进 行 E 2水 平 检 测 结 果 显 示 ， 疑 似 奶 牛 组 血 清 及 子 宫 回 收 液 E2水 平 均高 于 健 康 奶 牛 组 ， 但 差 异 不 显 著 （ P 0.05） 。 从 两 组 数 据 均 值 来 看 ， 血 清 样 中 E2水 平 均 高 于 子 宫 回 收液 (表 5)。 表 5 健 康 奶 牛 、 疑 似 奶 牛 血 液 及 子 宫 回 收 液 中 E2水 平组 别 样 本 数 (头 ) E2(pg/mL)血 清 子 宫 回 收 液疑 似 奶 牛 80 98.97 14.76 75.88 12.14健 康 奶 牛 80 89.93 16.27 78.56 15.65_
