1、ICS 65.020.20B 21备 案 号 ： 33041-2012 DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 800 2012两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR检 测 方 法 Procedure for testing seed purity of two-line system hybrid rice by SSR 2012 -01- 12发 布 2012- 05-04实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 800-2012 I 目 次前 言 .1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 原 理 .25
2、 核 心 引 物 确 定 原 则 .26 检 测 程 序 .27 结 果 计 算 .3附 录 A （ 资 料 性 附 录 ） NY/T1433-2007 推 荐 的 24 对 SSR引 物 序 列 .4 附 录 B （ 资 料 性 附 录 ） 47 对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR 检 测 常 用 引 物 序 列 .5附 录 C （ 规 范 性 附 录 ） 相 关 试 剂 配 制 .7 DB42/T 800-2012 II 前 言本 标 准 按 照 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写
3、给 出 的 规 则 起 草 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 提 出 并 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 湖 北 省 种 子 管 理 局 。本 标 准 主 要 起 草 人 ： 周 正 明 、 谢 建 平 、 李 彧 、 高 明 鑫 、 马 磊 。 DB42/T 8002012 1 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR检 测
4、 技 术 方 法 的 术 语 和 定 义 、 原 理 、 核 心 引 物 确 定 原 则 、检 测 程 序 和 结 果 计 算 。本 标 准 适 用 于 品 种 真 实 性 已 经 确 认 的 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 的 鉴 定 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 对 于 本 文 件 是 必 不 可 少 的 。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ， 凡 是不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。 GB/T 3543.4-
5、1995 农 作 物 种 子 检 验 规 程 发 芽 试 验NY/T 1433-2007 水 稻 品 种 鉴 定 DNA指 纹 方 法3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。3.1 简 单 重 复 序 列 SSR simple sequence repeats又 称 微 卫 星 序 列 或 串 联 重 复 序 列 ， 是 由 1-5个 核 苷 酸 为 重 复 单 位 聚 集 而 成 的 长 达 几 十 个 至 几 百 个 bp的 串 联 重 复 序 列 。3.2 聚 合 酶 链 式 反 应 PCR polymerase chain reaction一 种 用
6、 于 在 体 外 扩 增 DNA序 列 的 技 术 程 序 。 模 板 DNA经 高 温 变 性 分 解 为 两 条 单 链 ， 在 适 宜 温 度 下 ， 经DNA聚 合 酶 的 催 化 作 用 ， 两 条 引 物 分 别 与 DNA模 板 两 条 单 链 上 的 一 段 互 补 序 列 发 生 退 火 结 合 ， 然 后 在 DNA聚 合 酶 的 催 化 下 以 四 种 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 （ dNTP deoxyribonucleoside triphosphate） 为 底 物 ， 引 物 延伸 合 成 DNA。 如 此 变 性 分 解 、 退 火 结 合 和 延 伸 合 成
7、DNA反 复 循 环 ， 使 位 于 引 物 序 列 之 间 的 DNA片 段 呈 几 何倍 数 扩 增 。3.3 引 物 primer具 有 游 离 的 3-OH末 端 及 特 定 序 列 的 寡 核 苷 酸 短 片 段 ， 与 DNA模 板 结 合 后 启 动 PCR反 应 。3.4 亲 本 种 子 parental DB42/T 800-2012 2 用 于 配 制 大 田 生 产 杂 交 种 子 的 不 育 系 和 恢 复 系 种 子 。4 原 理简 单 重 复 序 列 分 布 于 水 稻 整 个 基 因 组 ， 每 个 位 点 上 重 复 单 位 的 数 目 及 重 复 单 位 的
8、序 列 都 可 能 不 完 全相 同 ， 因 而 造 成 了 对 应 座 位 上 的 多 态 性 。 由 于 每 个 简 单 重 复 序 列 两 端 的 序 列 是 高 度 保 守 的 单 拷 贝 序 列 ，因 而 可 根 据 其 两 端 的 序 列 设 计 一 对 特 异 引 物 ， 利 用 PCR技 术 进 行 扩 增 ， 扩 增 产 物 利 用 电 泳 进 行 分 离 ， 分析 其 长 度 多 态 性 ， 达 到 区 别 不 同 于 杂 交 种 的 目 的 。5 核 心 引 物 确 定 原 则在 水 稻 基 因 组 上 选 取 多 态 性 、 稳 定 性 、 重 复 性 等 综 合 特
9、性 好 的 引 物 作 为 核 心 引 物 （ 推 荐 引 物 序 列 见附 录 A、 附 录 B） 。 其 中 附 录 A引 自 NY/T 1433-2007 水 稻 品 种 鉴 定 DNA指 纹 方 法 ， 附 录 B为 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR检 测 常 用 引 物 。6 检 测 程 序6.1 样 品 数从 供 检 样 品 中 随 机 取 400粒 种 子 按 GB/T3543.4-1995 农 作 物 种 子 检 验 规 程 发 芽 试 验 标 准 中 规 定的 方 法 进 行 发 芽 ， 从 发 芽 的 幼 苗 中 随 机 取 192株 幼
10、苗 进 行 检 测 。 同 时 将 标 准 的 杂 种 及 其 父 、 母 本 设 为 对照 。 注 ： 为 增 加 室 内 SSR检 测 结 果 与 田 间 鉴 定 结 果 的 一 致 性 ， 可 随 机 选 取 192株 正 常 幼 苗 进 行 检 测 。6.2 DNA提 取截 取 0.5cm-1cm长 的 水 稻 幼 苗 ， 加 入 40l 1%NaOH溶 液 ， 在 沸 水 中 煮 30s， 然 后 加 入 60l 2： 1 HCl-Tris溶 液 ， 在 沸 水 中 煮 2min， 取 1l进 行 PCR扩 增 。6.3 特 定 引 物 筛 选利 用 亲 本 DNA， 在 核 心 引
11、 物 中 筛 选 出 具 有 较 好 多 态 性 、 亲 本 间 DNA片 段 差 异 较 大 ， 条 带 清 晰 的 引 物 ，作 为 特 定 引 物 对 供 检 样 品 进 行 检 测 。 引 物 的 选 用 还 应 考 虑 杂 交 种 的 生 产 情 况 ， 注 意 以 下 原 则 ：a、 对 亲 本 纯 度 较 高 、 去 杂 彻 底 ， 且 制 种 田 隔 离 效 果 较 好 的 ， 一 般 选 用 一 对 引 物 即 可 。b、 对 制 种 田 隔 离 条 件 较 差 ， 有 外 源 花 粉 污 染 的 ， 应 根 据 外 源 花 粉 类 型 增 加 引 物 对 原 模 板 DNA
12、进 行 再检 测 。c、 对 亲 本 中 杂 株 较 多 ， 或 去 杂 不 严 的 ， 应 根 据 亲 本 杂 株 类 型 增 加 引 物 对 原 模 板 DNA进 行 再 检 测 。6.4 PCR扩 增6.4.1 反 应 体 系 10l的 反 应 体 系 包 含 10M正 反 引 物 各 0.2l， 10mM的 dNTP 0.2l， 2U/l的 0.6l AmpliTaqGoldDNA聚 合 酶 ， 10倍 PCR反 应 液 （ 100mmol/L Tris-HCl， pH8.3， 15mmol/L MgCl2， 500mmol/L KCl， 0.01%的明 胶 ） 1l， 1l模 板 D
13、NA（ 约 10ng） 和 6.8l超 纯 水 。6.4.2 反 应 程 序 DB42/T 8002012 3 94 变 性 4min， 然 后 是 94 15s、 55 15s、 72 30s进 行 35个 循 环 ， 最 后 72 延 伸 5min。注 ： 此 程 序 中 55 15s， 其 温 度 为 参 考 温 度 ， 实 际 操 作 时 可 根 据 厂 家 提 供 的 引 物 说 明 书 设 置 。6.5 谱 带 分 离6.5.1 凝 胶 配 制称 取 4g Nusieve3:1 琼 脂 糖 ， 加 入 96ml1倍 TAE缓 冲 液 ， 室 温 下 放 置 30min， 在 微 波
14、 炉 中 煮 沸 8min，用 蒸 馏 水 加 至 原 来 体 积 ， 待 冷 却 至 60 左 右 时 ， 加 入 5l 溴 化 乙 锭 溶 液 并 混 匀 ， 倒 入 12 12cm的 制 胶盒 中 ， 插 好 制 胶 梳 ， 冷 却 后 ， 缓 慢 抽 去 制 胶 梳 ， 置 于 电 泳 槽 中 ， 用 于 上 样 。注 ： 上 样 孔 在 电 泳 槽 负 极 方 向6.5.2 上 样用 移 液 器 依 次 取 约 10l 扩 增 产 物 ， 按 顺 序 点 于 上 样 孔 。 每 排 上 样 孔 分 别 点 100bp 600bp marker、 父 、 母 亲 本 种 子 的 DNA
15、 扩 增 产 物 作 为 对 照 。6.5.3 电 泳 、 成 像将 上 样 的 琼 脂 糖 凝 胶 置 于 电 泳 槽 内 ， 接 通 电 泳 仪 电 源 ， 设 置 合 适 的 电 压 值 ， (一 般 为 6V/cm -10V/cm)，电 泳 约 30min。 电 泳 完 毕 后 ， 取 出 凝 胶 置 于 保 鲜 膜 上 ， 放 入 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 并 拍 照 。7 结 果 计 算以 亲 本 作 对 照 ， 鉴 定 各 样 品 电 泳 谱 带 的 特 征 和 一 致 性 ， 判 定 杂 株 类 型 。 其 带 型 与 母 本 一 致 的 定 为 不育 系 杂 株 ， 其
16、 他 与 杂 种 带 型 不 一 致 的 定 为 其 他 杂 株 。 然 后 按 下 列 公 式 计 算 纯 度 值 X.实 际 检 测 样 品 幼 苗 株 数 -不 育 系 杂 株 数 -其 他 杂 株 数 X（ %） = 100实 际 检 测 样 品 幼 苗 株 数注 ： 如 使 用 多 对 引 物 进 行 检 测 ， 需 对 所 用 的 每 对 引 物 分 别 给 出 计 算 结 果 ， 并 说 明 引 物 筛 选 方 法 。A DB42/T 800-2012 4 AB附 录 A（ 资 料 性 附 录 ）NY/T1433-2007推 荐 的 24对 SSR引 物 序 列表 A.1 NY/
17、T1433-2007推 荐 的 24对 SSR引 物 序 列引 物 名 称 正 向 序 列 (5 -3 ) 反 向 序 列 (3 -5 )RM297 TCTTTGGAGGCGAGCTGAG CGAAGGGTACATCTGCTTAGRM71 CTAGAGGCGAAAACGAGATG GGGTGGGCGAGGTAATAATGRM85 CCAAAGATGAAACCTGGATTG GCACAAGGTGAGCAGTCC RM5414 ACCATGGTTCAAGAGTGAAA ACAGCTCAACCTGTTGAGTGRM274 CCTCGCTTATGAGAGCTTCG CTTCTCCATCACTCCCAT
18、GGRM190 CTTTGTCTATCTCAAGACAC TTGCAGATGTTCTTCCTGATGRM336 CTTACAGAGAAACGGCATCG GCTGGTTTGTTTCAGGTTCGRM72 CCGGCGATAAAACAATGAG GCATCGGTCCTAACTAAGGGRM219 CGTCGGATGATGTAAAGCCT CATATCGGCATTCGCCTGRM311 TGGTAGTATAGGTACTAAACAT TCCTATACACATACAAACATACRM209 ATATGAGTTGCTGTCGTGCG CAACTTGCATCCTCCCCTCCRM19 CAAAAACAGA
19、GCAGATGAC CTCAAGATGGACGCCAAGARM1195 ATGGACCACAAACGACCTTC CGACTCCCTTGTTCTTCTGGRM208 TCTGCAAGCCTTGTCTGATG TAAGTCGATCATTGTGTGGACCRM232 CCGGTATCCTTCGATATTGC CCGACTTTTCCTCCTGACG RM273 GAAGCCGTCGTGAAGTTACC GTTTCCTACCTGATCGCGACRM267 TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG AGCAACAGCACAACTTGATGRM253 TCCTTCAAGAGTGCAAAACC GCAT
20、TGTCATGTCGAAGCCRM18 TTCCCTCTCATGAGCTCCAT GAGTGCCTGGCGCTGTACRM337 GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG CGATAGATAGCTAGATGTGGCCRM258 TGCTGTATGTAGCTCGCACC TGGCCTTTAAAGCTGTCGCRM278 GTAGTGAGCCTAACAATAATC TCAACTCAGCATCTCTGTCCRM224 ATCGATCGATCTTCACGAGG TGCTATAAAAGGCATTCGGGRM17 TGCCCTGTTATTTTCTTCTCTC GGTGATCCTTTCCCATTTCA DB
21、42/T 8002012 5 附 录 B（ 资 料 性 附 录 ）47 对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR检 测 常 用 引 物 序 列表 B.1 47对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR检 测 常 用 引 物 序 列引 物 名 称 正 向 序 列 (5 -3 ) 反 向 序 列 (3 -5 )RM212 CCACTTTCAGCTACTACCAG CACCCATTTGTCTCTCATTATGRM276 CTCAACGTTGACACCTCGTG TCCTCCATCGAGCAGTATCARM242 GGCCAACGTGTGTAT
22、GTCTC TATATGCCAAGACGGATGGGRM110 TCGAAGCCATCCACCAACGAAG TCCGTACGCCGACGAGGTCGAGRM286 GGCTTCATCTTTGGCGAC CCGGATTCACGAGATAAACTC RM263 CCCAGGCTAGCTCATGAACC GCTACGTTTGAGCTACCACGOSR28 AGCAGCTATAGCTTAGCTGG ACTGCACATGAGCAGAGACARM1 GCGAAAACACAATGCAAAAA GCGTTGGTTGGACCTGACRM234 ACAGTATCCAAGGCCCTGG ACAGTATCCAAGG
23、CCCTGGRM424 TTTGTGGCTCACCAGTTGAG TGGCGCATTCATGTCATCRM243 GATCTGCAGACTGCAGTTGC AGCTGCAACGATGTTGTCCRM264 GTTGCGTCCTACTGCTACTTC GATCCGTGTCGATGATTAGCRM21 ACAGTATTCCGTAGGCACGG GCTCCATGAGGGTGGTAGAGRM201 CTCGTTTATTACCTACAGTACC CTACCTCCTTTCTAGACCGATARM202 CAGATTGGAGATGAAGTCCTCC CCAGCAAGCATGTCAATGTARM204 GTG
24、ACTGACTTGGTCATAGGG GCTAGCCATGCTCTCGTACCRM302 TCATGTCATCTACCATCACAC ATGGAGAAGATGGAATACTTGC RM11 TCTCCTCTTCCCCCGATC ATAGCGGGCGAGGCTTAGRM247 TAGTGCCGATCGATGTAACG CATATGGTTTTGACAAAGCGRM251 GAATGGCAATGGCGCTAG ATGCGGTTCAAGATTCGATCRM164 TCTTGCCCGTCACTGCAGATATCC GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTCRM154 ACCCTCTCCGCCTCG
25、CCTCCTC CTCCTCCTCCTGCGACCGCTCCRM341 CAAGAAACCTCAATCCGAGC CTCCTCCCGATCCCAATCRM246 GAGCTCCATCAGCCATTCAG CTGAGTGCTGCTGCGACTRM310 CCAAAACATTTAAAATATCATG GCTTGTTGGTCATTACCATTCRM26 GAGTCGACGAGCGGCAGA CTGCGAGCGACGGTAACARM16 CGCTAGGGCAGCATCTAAA AACACAGCAGGTACGCGCRM135 CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG TCAGCTTCTGGCCGGC
26、CTCCTCRM136 GAGAGCTCAGCTGCTGCCTCTAGC GAGGAGCGCCACGGTGTACGCC RM152 GAAACCACCACACCTCACCG CCGTAGACCTTCTTGAAGTAGRM160 AGCTAGCAGCTATAGCTTAGCTGGAGATCG TCTCATCGCCATGCGAGGCCTCRM186 TCCTCCATCTCCTCCGCTCCCG GGGCGTGGTGGCCTTCTTCGTCRM226 AGCTAAGGTCTGGGAGAAACC AAGTAGGATGGGGCACAAGCTCRM235 AGAAGCTAGGGCTAACGAAC TCACC
27、TGGTCAGCCTCTTTC DB42/T 800-2012 6 表 B.1 47 对 湖 北 省 现 有 两 系 杂 交 水 稻 品 种 纯 度 SSR 检 测 常 用 引 物 序 列 (续 )RM287 TTCCCTGTTAAGAGAGAAATC GTGTATTTGGTGAAAGCAACRM340 GGTAAATGGACAATCCTATGGC GACAAATATAAGGGCAGTGTGCRM7 TTCGCCATGAAGTCTCTCG CCTCCCATCATTTCGTTGTTRM317 CATACTTACCAGTTCACCGCC CTGGAGAGTGTCAGCTAGTTGARM307 GT
28、ACTACCGACCTACCGTTCAC CTGCTATGCATGAACTGCTCRM480 GCTCAAGCATTCTGCAGTTG GCGCTTCTGCTTATTGGAAGRM30 GGTTAGGCATCGTCACGG TCACCTCACCACACGACACGRM3 ACACTGTAGCGGCCACTG CCTCCACTGCTCCACATCTTRM214 CTGATGATAGAAACCTCTTCTC AAGAACAGCTGACTTCACAARM248 TCCTTGTGAAATCTGGTCCC GTAGCCTAGCATGGTGCATG RM304 TCAAACCGGCACATATAAGAC
29、GATAGGGAGCTGAAGGAGATGRM271 TCAGATCTACAATTCCATCC TCGGTGAGACCTAGAGAGCCRM216 GCATGGCCGATGGTAAAG TGTATAAAACCACACGGCCA DB42/T 8002012 7 BC附 录 C（ 规 范 性 附 录 ）相 关 试 剂 配 制C.1 0.5mol/LTris-HCl溶 液 (PH8.0)： 称 取 60.5克 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris） ， 加 入 400ml 双 蒸 水中 溶 解 ， 加 入 浓 盐 酸 29.7ml， 加 水 定 溶 至 1000ml。C.2 2:1 HCl
30、-Tris溶 液 :0.25 mol/L HCl与 0.5 mol/L Tris-HCl (PH8.0)按 2:1配 制 。C.3 0.5 mol/L EDTA溶 液 （ PH8.0） ： 称 取 186.6 克 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 （ Na 2EDTA.2H2O） , 加 入 700ml双 蒸 水 中 溶 解 ， 加 入 20 克 NaOH， 加 水 定 溶 至 1000ml。C.4 0.1 倍 TE 缓 冲 液 ： 取 1 ml 1mol/L Tris 溶 液 (PH8.0)和 0.2 ml 0.5 mol/L EDTA溶 液 （ PH8.0） ，加 水 定 溶 至 1000m
31、l。C.5 50 倍 的 TAE 电 极 缓 冲 液 : 称 取 242.2 克 三 羟 甲 基 氨 基 甲 烷 （ Tris） ， 加 入 100 ml 0.5M EDTA 溶液 （ PH8.0） 和 57.1ml冰 乙 酸 ， 加 水 定 溶 至 1000ml。 用 时 稀 释 50倍 。C.6 6 倍 上 样 缓 冲 液 ： 0.25%的 溴 酚 兰 ， 40%（ W/V） 蔗 糖 。 称 取 0.25 克 溴 酚 兰 和 40 克 蔗 糖 ， 用 双 蒸水 定 容 至 100ml。 用 时 稀 释 6倍 。C.7 1000 倍 溴 化 乙 锭 溶 液 ： 称 取 50mg 溴 化 乙 锭 定 溶 于 100ml 双 蒸 水 中 ， 配 成 0.5mg/ml 的 1000 倍 贮存 液 ， 用 时 按 1： 1000 稀 释 配 制 染 色 液 ， 溶 液 要 4 避 光 避 光 （ 溴 化 乙 锭 是 一 种 诱 变 剂 ） 。_
