1、ICS 11.220B 41备 案 号 ： DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T 734 2011牛 分 枝 杆 菌 抗 体 胶 体 金 试 纸 条 检 测 方 法 Colloidal Gold Strips to Detect the Antibody against Mycobacterium bovis 2011 -08- 18发 布 2011- 09-18实 施湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 DB42/T 7342011 I 目 次前 言 .II引 言 .III1 范 围 .12 术 语 与 定 义 .13 缩 略 语 .14 原 理 .15 牛 结 核 病
2、抗 体 胶 体 试 纸 条 检 测 方 法 .25.1 仪 器 与 耗 材 .2 5.2 操 作 步 骤 .2附 录 A（ 规 范 性 附 录 ） 采 样 与 样 品 处 理 注 意 事 项 .3附 录 B（ 规 范 性 附 录 ） 牛 分 枝 杆 菌 MPB70/83抗 体 检 测 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 .4 DB42/T 7342011 II 前 言本 标 准 按 GB/T 1.1-2009 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分 ： 标 准 的 结 构 和 编 写 给 出 的 规 则 起 草 。本 文 件 的 发 布 机 构 提 请 注 意 ， 声 明 符 合 文 件
3、时 ， 可 能 涉 及 到 附 录 B与 胶 体 金 试 纸 条 制 备 相 关 的 专 利的 使 用 。本 文 件 的 发 布 机 构 对 于 该 专 利 的 真 实 性 、 有 效 性 和 范 围 无 任 何 立 场 。该 专 利 持 有 人 已 向 本 文 件 的 发 布 机 构 保 证 ， 他 愿 意 同 任 何 申 请 人 在 合 理 且 无 歧 视 的 条 款 和 条 件 下 ，就 专 利 授 权 许 可 进 行 谈 判 。 该 专 利 持 有 人 的 声 明 已 在 本 文 件 的 发 布 机 构 备 案 。 相 关 信 息 可 以 通 过 以 下 联系 方 式 获 得 ：专 利
4、 持 有 人 姓 名 ： 华 中 农 业 大 学 。地 址 ： 武 汉 市 洪 山 区 狮 子 山 街 1号 。 请 注 意 除 上 述 专 利 外 ， 本 文 件 的 某 些 内 容 仍 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利的 责 任 。本 标 准 由 华 中 农 业 大 学 提 出 。本 标 准 由 湖 北 省 农 业 厅 归 口 。本 标 准 起 草 单 位 ： 华 中 农 业 大 学 。本 标 准 起 草 人 ： 郭 爱 珍 、 陈 颖 钰 、 廖 娟 红 、 晁 金 、 凌 洁 玉 、 陈 焕 春 、 杨 利 国 、 胡 长
5、敏 。 DB42/T 7342011 III 引 言牛 结 核 病 主 要 是 由 牛 分 枝 杆 菌 （ Mycobacterium bovis） 引 起 的 一 种 人 兽 共 患 的 慢 性 传 染 病 ， 呈 世 界性 分 布 。 世 界 动 物 卫 生 组 织 （ OIE） 将 其 列 为 必 须 通 报 疫 病 与 国 际 贸 易 必 检 对 象 ， 我 国 将 其 列 为 二 类 动物 疫 病 。 临 床 上 以 肺 结 核 、 乳 房 结 核 和 肠 结 核 最 为 常 见 ， 健 康 牛 可 通 过 被 污 染 的 空 气 、 饲 料 和 饮 水 等 经呼 吸 道 和 消 化
6、 道 等 途 径 感 染 。 随 着 近 年 来 我 国 奶 牛 业 的 蓬 勃 发 展 ， 我 国 牛 结 核 病 呈 上 升 趋 势 。 我 省 近 年来 奶 牛 养 殖 数 量 不 断 增 加 ， 牛 结 核 病 防 控 形 势 严 峻 。国 际 通 用 的 牛 结 核 病 控 制 方 法 是 “ 检 疫 扑 杀 ” ， 因 此 ， 准 确 检 测 牛 结 核 病 是 净 化 与 控 制 牛 结 核 病的 前 提 。 目 前 法 定 的 检 疫 方 法 为 牛 结 核 菌 素 皮 内 变 态 反 应 ， 该 方 法 操 作 费 时 繁 琐 ， 需 要 专 业 技 术 人 员 操作 ， 结
7、 果 判 断 程 序 复 杂 且 主 观 性 强 ， 在 环 境 分 枝 杆 菌 感 染 时 易 出 现 假 阳 性 反 应 ， 免 疫 抑 制 或 结 核 病 病 程后 期 动 物 对 结 核 菌 素 的 反 应 性 降 低 。 牛 分 枝 杆 菌 抗 体 胶 体 金 检 测 试 纸 条 是 用 牛 分 枝 杆 菌 特 异 性 蛋 白 检 测 牛 分 枝 杆 菌 抗 体 的 一 种 方 法 。 该方 法 简 化 了 牛 结 核 病 检 测 的 操 作 程 序 ， 可 在 栏 圈 旁 检 测 ， 省 时 省 力 ， 简 便 快 速 。 本 标 准 的 出 台 将 为 牛 结核 病 的 快 速
8、诊 断 提 供 有 力 的 技 术 依 据 ， 有 助 于 我 省 乃 至 全 国 养 牛 业 的 健 康 发 展 。 DB42/T 7342011 1 牛 分 枝 杆 菌 抗 体 胶 体 金 试 纸 条 检 测 方 法1 范 围本 标 准 规 定 了 牛 分 枝 杆 菌 抗 体 胶 体 金 试 纸 条 检 测 方 法 的 原 理 和 操 作 步 骤 。本 标 准 适 用 于 牛 结 核 病 的 诊 断 、 检 疫 、 监 测 与 流 行 病 学 调 查 。2 术 语 与 定 义下 列 术 语 与 定 义 适 用 于 本 标 准 。2.1 胶 体 金 colloidal gold strip金
9、 原 子 和 胶 体 （ 如 牛 血 清 蛋 白 ） 通 过 静 电 引 力 、 范 氏 力 等 结 成 的 组 合 体 。2.2 多 克 隆 抗 体 polyclonal antibody多 种 抗 原 表 位 刺 激 机 体 免 疫 系 统 后 ， 机 体 产 生 的 针 对 不 同 抗 原 表 位 的 混 合 抗 体 。3 缩 略 语3.1 磷 酸 盐 缓 冲 液 phosphate buffer solution PBS3.2 牛 分 枝 杆 菌 特 异 性 蛋 白 70 MPB70 3.3 牛 分 枝 杆 菌 特 异 性 蛋 白 83 MPB834 原 理牛 感 染 牛 分 枝 杆
10、菌 后 ， 会 产 生 针 对 该 菌 的 特 异 性 抗 体 ， 其 中 MPB70和 MPB83是 刺 激 抗 体 产 生 的 重 要 细菌 蛋 白 ， 且 具 有 抗 原 相 似 性 。 将 胶 体 金 标 记 MPB83， 并 加 至 金 标 垫 上 ， 将 MPB70（ 检 测 带 蛋 白 ） 和 MPB83多 克 隆 抗 体 （ 质 控 带 蛋 白 ） 分 别 包 被 在 硝 酸 纤 维 素 膜 上 ， 将 金 标 垫 、 硝 酸 纤 维 素 膜 、 样 本 垫 、 吸 水 垫 和PVC背 撑 等 一 起 组 装 成 检 测 板 。 待 检 牛 血 清 加 到 试 纸 条 一 端
11、的 样 本 垫 上 后 ， 通 过 毛 细 作 用 向 前 移 动 ， 与金 标 垫 上 的 胶 体 金 标 记 MPB83相 遇 并 结 合 ， 当 进 一 步 移 动 至 固 定 的 MPB70区 域 时 ， 待 检 血 清 与 金 标 MPB83的 结 合 物 又 与 MPB70发 生 特 异 性 结 合 而 被 截 留 ， 聚 集 在 检 测 带 上 ， 肉 眼 即 可 观 察 到 检 测 线 上 的 胶 体 金 显色 带 。 待 检 血 清 与 金 标 MPB83的 结 合 物 进 一 步 移 动 至 固 定 的 MPB83抗 体 区 域 时 ， 又 与 MPB83抗 体 反 应 ，
12、 肉眼 即 可 观 察 到 质 控 线 上 的 胶 体 金 显 色 带 。 因 此 ， 牛 结 核 病 阳 性 时 ， 胶 体 金 试 纸 条 出 现 检 测 带 与 质 控 带 两条 带 ； 而 牛 结 核 病 阴 性 时 ， 则 只 出 现 一 条 质 控 带 。 DB42/T 7342011 2 5 牛 结 核 病 抗 体 胶 体 试 纸 条 检 测 方 法5.1 仪 器 与 耗 材滴 管 、 高 压 消 毒 锅 、 一 次 性 注 射 器 。牛 分 枝 杆 菌 MPB70/83抗 体 检 测 胶 体 金 试 纸 条 ， 应 符 合 相 关 产 品 的 质 量 标 准 （ 见 附 录 B
13、） 。5.2 操 作 步 骤5.2.1 样 品 处 理无 菌 采 集 待 检 牛 血 液 2 mL， 分 离 血 清 ， 立 即 检 测 或 -20 保 存 待 检 。5.2.2 胶 体 金 试 验 操 作 步 骤取 待 检 血 清 样 品 100 L 120 L（ 滴 管 5滴 6滴 ） ， 缓 慢 滴 加 到 样 品 孔 中 ， 试 纸 条 上 将 有 红 色 条 带 移 动 。 若 一 分 钟 后 仍 然 没 有 条 带 移 动 ， 向 样 品 孔 中 再 加 入 1滴 待 检 血 清 样 品 。 静 置 10 min， 观 察 结 果 。5.2.3 结 果 判 定结 果 判 断 如 下
14、 图 所 示 。(1) 阳 性 结 果 （ A） ： 在 试 纸 条 上 出 现 两 条 红 色 条 带 （ 检 测 带 和 质 控 带 ） 。(2) 阴 性 结 果 （ B） ： 在 试 纸 条 上 仅 出 现 一 条 红 色 条 带 （ 质 控 带 ） 。(3) 无 效 结 果 （ C和 D） ： 在 质 控 带 处 不 出 现 红 色 条 带 。质 控 带 检 测 带 DB42/T 7342011 3 AA附 录 A（ 规 范 性 附 录 ）采 样 与 样 品 处 理 注 意 事 项本 附 录 规 定 了 采 样 与 样 品 处 理 注 意 事 项 。A.1 采 血 及 血 样 处 理
15、过 程 ， 应 进 行 无 菌 操 作 。 存 放 血 样 的 容 器 应 洁 净 和 无 菌 。A.2 采 样 及 实 验 过 程 中 应 注 意 个 人 防 护 ， 戴 口 罩 、 穿 工 作 服 和 戴 一 次 性 手 套 。A.3 待 用 的 带 滤 芯 吸 嘴 、 吸 嘴 和 离 心 管 等 应 经 过 高 压 灭 菌 处 理 。A.4 每 次 操 作 后 应 及 时 用 70%乙 醇 或 10%次 氯 酸 钠 溶 液 消 毒 处 理 检 测 区 。 操 作 区 应 有 专 门 的 废 弃 物 容器 ， 废 弃 物 应 经 高 压 消 毒 后 方 可 按 有 关 规 定 处 置 。
16、A.5 应 符 合 病 原 微 生 物 实 验 室 生 物 安 全 管 理 条 例 的 其 它 生 物 安 全 技 术 要 求 。 DB42/T 7342011 4 BB附 录 B（ 规 范 性 附 录 ）牛 分 枝 杆 菌 MPB70/83抗 体 检 测 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备附 录 B给 出 了 牛 分 枝 杆 菌 MPB70/83抗 体 检 测 胶 体 金 试 纸 条 的 制 备 标 准 。克 隆 表 达 和 纯 化 MPB70和 MPB83， 制 备 和 纯 化 兔 抗 MPB83蛋 白 多 克 隆 抗 体 和 MPB83-胶 体 金 复 合 物 。 将MPB83-胶 体 金 复 合 物 加 至 金 标 垫 上 ， 将 MPB70（ 检 测 带 ） 和 MPB83多 克 隆 抗 体 （ 质 控 带 ） 分 别 包 被 在 硝 酸纤 维 素 膜 上 ， 将 金 标 垫 、 硝 酸 纤 维 素 膜 、 样 本 垫 、 吸 水 垫 和 PVC背 撑 等 一 起 组 装 成 检 测 试 纸 条 。 _
