1、 1 ICS 65.020 B 62 备案号： DB42 湖北省 地 方 标 准 DB42/T 1448 2018 蝴蝶兰组培苗工厂化生产技术规程 Code of practice for tissue culture of phalaenopsis seedling in industrial production （报批稿） 2018-09-11 发布 2018-12-10 实施 湖北省质量技术监督局 发布 DB42/T 1448 2018 I 目 次 前言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语与定义 . 1 3.1 组培苗 in vitro plantlet
2、 . 1 3.2 中苗 medium sized plantlet . 1 3.3 成品苗 the finished product plantlet . 1 4 设施条件 . 1 5 培养基配制 . 2 5.1 水质要求 . 2 5.2 培养基配制及分装 . 2 5.3 培养基灭菌 . 2 5.4 培养基储存 . 2 6 组织培养操作方法 . 2 6.1 操作前准备 . 2 6.2 外植体选择与消毒 . 2 6.3 增殖与继代培养 . 3 6.4 壮苗培养 . 3 6.5 生根培养 . 3 6.6 接种 . 4 7 组培苗培养管理 . 4 7.1 组培苗摆放 . 4 7.2 培养条件 . 5
3、 8 炼苗与移栽 . 5 9 报损预防 . 5 9.1 预防原则 . 5 9.2 降低污染 . 6 10 包装、标识和储运 . 6 10.1 包装 . 6 10.2 标识 . 6 10.3 储运 . 6 11 生产档案 . 7 11.1 档案记录要求 . 7 11.2 档案管理要求 . 7 DB42/T 1448 2018 II DB42/T 1448 2018 III 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 本标准由 武汉市农业科学院提出。 本标准由 湖北省农业科学院归口。 本标准 起草单位：武汉市农业科学院作物研究所、武
4、汉维尔福生物科技股份有限公司 。 本标 准主要起草人：张 娜、任 俭 、曾红霞 、 汤 谧、孙玉宏、王 蕾、程维舜、杨皓琼、陈 伟、 高红霞、熊建顺 。 DB42/T 1448 2018 1 蝴蝶兰组培苗工厂化生产技术规程 1 范围 本标准规定了蝴蝶兰 （ Phalaenopsis spp.） 组培苗工厂化生产 的 术语与定义 、 设施条件 、 培养基配 制、组织培养操作方法、组培苗培养管理、炼苗移栽、报损预防、 包装、标识和储运 及生产档案。 本标准适用于湖北区域相似工厂化生产条件下蝴蝶兰组培苗的生产 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日
5、期的版本适用于本文件 。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程 DB42/T 1116-2015 观赏花卉 蝴蝶兰盆花设施栽培生产技术规程 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 组培苗 in vitro plantlet 在无菌和人工条件下通过植物组织培养技术获得的各规格试管苗。 3.2 中苗 medium sized plantlet 经组织 培养 形成 的叶色正常、株高 在 1 cm 2 cm的健壮组培苗。 3.3 成品苗 the finished product plantlet 经组
6、织培养形成的叶色正常、株高在 2.5 cm以上、具有 2条 3条根 、经炼苗后可出瓶移栽 的健壮组 培苗。 4 设施条件 DB42/T 1448 2018 2 选址、设计要求、设备器材及试剂参照 NY/T 2306-2013 中的相关要求 合理配 备 。 5 培养基配制 5.1 水质要求 培养基配制用水水质应符合 NY/T 2306-2013表 B.1（续）的要求。 5.2 培养基配制及分装 根据不同品种和不同培养阶段要求配制不同种类的培养基，培养基主要成分和化学试剂的质量控制 参照 NY/T 2306-2013的要求。 定容后搅拌均匀， 以 0.1 mol/L的 NaOH、 HCl溶液 或其
7、他有效溶液 调整 pH 值后 ， 根据不同培养要求每培养瓶分装 100 ml 120 ml，标明编号、配制日期等信息。 5.3 培养基灭菌 高温高压灭菌压力 9.8104 Pa 10.8104 Pa，温度（ 121 2），灭菌时间 15 min 25 min。 5.4 培养基储存 灭菌后 的 培养基按编号归类层叠堆放，平置冷却。培养基存储温度不高于 25 ， 尽量避光避粉尘， 存储时间 不超过 30 d。 6 组织培养操作方法 6.1 操作前准备 接种前打开超净工作台的紫外灯 30 min，灭菌完后打开风机 20min，风速 20 m/min 30 m/min。 操 作人员进入无菌室前首先清洗
8、双手，再换上个人专用的制服、鞋帽。 操作台及器具表面用 75 %酒精或 其他有效消毒溶液擦拭消毒，操作台内不放不必要的物品。 6.2 外植体选择与消毒 6.2.1 外植体选择 符合市场需求和消费习惯的蝴蝶兰品种 ，要求观赏性状好、生长健壮、无病虫害、花期长。根据需 要取蝴蝶兰成熟果荚、幼嫩花梗等部位。 6.2.2 外植体消毒 与接种 6.2.2.1 果荚消毒 与接种 DB42/T 1448 2018 3 以清水洗净果荚表面灰尘， 后用流水将其冲洗 10 min 30 min， 再在操作台上以 75 %酒精擦拭 1遍， 切除果柄，以 2 %的 NaClO溶液 消毒 20 min 30 min或其
9、他有效 消毒溶液 消毒 后，以无菌水清洗 4次 5 次 。 用 无菌 解剖刀将果荚 两端 尖头部分切除，再纵向剖开， 将 种子 接种于培养瓶， 均匀分布于培养基表 面 ，封好瓶口后进行培养 。 6.2.2.2 花梗消毒 与接种 花梗 取回后先以清水洗净表面灰尘，再在操作台上以 75 %酒精擦拭 1遍， 切成 5 cm左右的花梗段， 用 2 %的 NaClO溶液或其他有效 消毒溶液 进行 2次消毒：第一次 放入盛有足量消毒溶液、经高温高压灭菌 的玻璃器皿中消毒 ， 消毒时间 根据 花梗成熟性 而定，一般 8 min 40 min， 后以无菌水清洗 4次 5次； 第二次用高温消毒后的镊 子剥除包被
10、腋芽的苞叶，露出腋芽，再用消毒溶液消毒 6 min 9 min，以无菌 水清洗 4次 5次 。 消毒完成的 带腋芽花梗斜切成 1 cm 1.5 cm的花梗段，插入相应 培养基 ，使腋芽垂直于培养基向上 且不接触培养基，每培养瓶接种 3个 4个花梗段，封好瓶口后进行培养 。 培养基为 MS+0.5 mg L 3 mg L 6-BA+0 mg L 0.5 mg L NAA+20 g/L蔗糖 +7 g L 8 g L 琼脂， pH值为 5.2 5.8。 6.3 增殖与继代培养 外植体接种后 30 d 60 d进行增殖培养， 30 d 60 d后进 行继代培养。继代、增殖培养基为 MS+2 mg L
11、5 mg L 6-BA+0.3 mg L 1.5 mg L NAA+0 g L 2 g/L 活性炭 +20 g/L蔗糖 +7 g L 8 g L 琼脂， pH值为 5.2 5.8。 6.4 壮苗培养 继代培养后达到 1 cm以上的芽苗可根据需要分成单株进行壮苗培养。壮苗培养基为 MS+20 g L蔗 糖 +7 g L 8 g L琼脂 +1 g L 2 g/L活性炭， pH值为 5.2 5.8。 6.5 生根培养 壮苗培养后，剔除变异苗及细弱苗，挑选茎段长度为 1.5 cm左右、叶长 2.5 cm左右， 且生长健壮、 长势一致的无根苗进行生根培养。生根培养基为 MS+0.1 mg L 1 mg
12、L IBA+0.1 mg L 1 mg L NAA+15 g L 20 g/L蔗糖 +7 g L 8 g L琼脂 +1 g L 2 g/L活性炭， pH值为 5.2 5.8。 DB42/T 1448 2018 4 6.6 接种 6.6.1 接种方法 接种首先 去除表面附着的培养基、不正常组织，再将 培养物 按 不同要求进行分切操作，并 接种于不 同培养基。夹苗时手要轻，按规定操作，接种时按由内向外顺序进行，外围芽距离瓶壁 0.3 cm 左右， 叶片 不 接触瓶壁。 接种装瓶时芽的 大小 、 接种深度 和 数量 等应 符合 6.6.2 的规定。 6.6.2 装瓶要求 按实生苗和分生苗进行装瓶，具
13、体要求如下： a） 实生苗： 播 种：芽球 ， 35 棵 /瓶 40 棵 /瓶，均匀分布。 中母瓶： 35 株 /瓶，要求：中间 20 株，外围 15 株， 株高 2 cm 以 下， 大小均匀。 成 瓶： 22 株 /瓶，要求：中间 10 株，外围 12 株， 株高 2 cm 以上，均匀分布，大小一致。 b） 分生苗： 切 芽： 25 株 /瓶 ， 要求：中间 13 株，外围 12 株， 接种 深度在芽的 1/3 处，株高 2 cm 左右 。 35 株 /瓶 ， 要求：中间 20 株，外围 15 株， 接种 深度在 芽的 1/3 处，株高 1 cm 2 cm。 中母瓶： 24 株 /瓶，要求：
14、中间 12 株，外围 12 株，中间稍微可比外围大 ，株高 2 cm 左右。 成 瓶： 11 株 /瓶，要求：最内 1 株，中间 3 株，最外 围 7 株 ，株高 2.5 cm 以上。 16 株 /瓶， 要求： 最内 2 株，中间 5 株，最外围 9 株，株高 2 cm 2.5 cm。 6.6.3 封口 做好的产品盖上盖子，写好日期、编号、操作员代号等，填写接种日记录后，搬到指定培养室培养。 6.6.4 注意事项及安全管理 接种注意事项及接种操作的安全管理 按照 NY/T 2306-2013中 10.5接种 的相关规定 执行 。 7 组培苗培养管理 7.1 组培苗摆放 DB42/T 1448
15、2018 5 组培苗在无菌操作间完成后，放于统一规格的托盘，运至组培苗培养间，根据要求分类整齐摆放 于培养架上。 7.2 培养条件 组培苗培养间由专人负责温度、湿度、光照强度等培养条件的监控、记录和调整，每日上午、下午、 晚间各调查记 录 2次，及时作出 调整 。 7.2.1 温度 调控 蝴蝶兰 组培苗 适宜的生长温度为 24 28 。 具体 控温要求： a) 母瓶培养 间 ， 24 28 ，冬 季允 许在此标准下调 1 2 ； b) 丛生芽培养间， 25 27 ，冬 季允 许 在此标准下调 1 2 ； c) 中苗培养间， 24 29 ，冬 季允 许 在此标准下调 1 2 ； d) 成品苗培养
16、间， 25 27 ，冬 季允 许 在此标准下调 1 2 。 7.2.2 湿度 调控 培养间 相对湿度 宜为 60 %左右，超过 60 %抽湿降湿。 7.2.3 光照 调控 培养间光照宜控制在 18 mol m-2 s-1 63 mol m-2 s-1。 母瓶培养 间 和丛生芽培养间光照强度宜为 18 mol m-2 s-1 36 mol m-2 s-1； 中苗培养和成品苗培养间 36 mol m-2 s-1 63 mol m-2 s-1。光照时 间宜为 8 h/d 16 h/d， 新接种的甁苗在 3 d 7 d 内 避光培养 。 根据不同品种特性适当调节光照强度和光照时间。 8 炼苗与移栽 经
17、组织培养形成的无污染、生长健康 、 株高 2.5 cm以上 ，且 具有 3片 4片叶、 2条 4条健壮根 的 组 培苗 可进行炼苗移栽 。 炼苗和移栽按照 DB42/T 1116-2015 观赏花卉 蝴蝶兰盆花设施栽培生产技术规程 中 5栽培管理规定的方法进行。 9 报损预防 9.1 预防原则 报损主要有培养物污染和培养瓶破损两种，应加强管理，预防为主。 DB42/T 1448 2018 6 9.2 降低污染 9.2.1 严格操作规程 灭菌消毒、接种操作、培养管理等整个生产过程 符合 NY/T 2306-2013中的相关规定 。 9.2.2 环境及器具消毒 每 7 d对 工作服、口罩、帽子等布
18、质品进行湿热灭菌 （最好使用一次性口罩和帽子）。每个月 清洗 或更换超净工作台 初效 过滤器，并对台面 进行 消毒 。每 1个月 3个月 对接种室与培养室 进行 消毒 。 已污染的组培瓶经高温高压灭菌后再清洗；培养容器、封口材料等器具在使用前严格清洗和消毒； 灭菌前检查灭菌锅的使用情况，发现问题立即检修；灭菌过程保证应达到的压力、时间，压力表降到零 后不能马上出锅，防止外界冷空气倒吸引起污染。 10 包装、标识和 储 运 10.1 包装 包装基本参照 NY/T 2306-2013 中规定的方法进行，具体细节根据实际情况进行适当调整。 10.1.1 带瓶包装 提前挑除污染及不合要求的产品。用气泡
19、棉将成品瓶装好，以胶带封口，放入合适规格的包装箱， 层与层之间及顶层用泡沫棉隔开，胶带封箱，塑带绑定。注明品种、装箱数量及日期、产品说明、注意 事项等信息。 10.1.2 裸根苗包装 用镊子将组培苗从培养瓶中取出，不要伤及叶片和根部；去除附着的培养基，剔除畸形叶片或黄叶 超过 3片、根系不健康的组培苗；每组 25株，装入包装盒，注意不要扭曲、弄伤叶片和根；盒外用保鲜 膜轻裹；封箱方法同 10.1.1。 10.2 标识 包装箱外 应注明产品名称、品种名、花色、质量等级、产品数量、产地、生产单位、包装日期 、 包 装储运图示标志等。 10.3 储运 DB42/T 1448 2018 7 装运 储 存的场所 和运输过程宜 保持 18 20 。 11 生产档案 11.1 档案记录要求 建立 蝴蝶兰组培苗 生产档案，主要包括 日常 温度、湿度、光照 及接种人员、 时间，对生产技术各环 节所采取的措施进行详细记录。 11.2 档案管理要求 建立种苗质量可追溯制度，有专人管理，确保覆盖整个生产管理周期的档案资料齐全，种苗来源清 楚、去向明确。所有记录真实、准确、规范，档案保存期限不少于 2年。 _ _
