1、ICS 11.22 B 41 备案号： DB42 湖北省 地 方 标 准 DB 42/T 1109 2015 牛流行热诊断和防治技术规范 Technique guideline on diagnosis, treatment and prevention of bovine ephemeral fever （报批稿） 2015 - 10 - 30 发布 2015 - 12 - 20 实施 湖北省质量技术监督局 发布 DB42/T 11092015 I 目 次 前言 . II 引言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 诊断 . 1 3.1 诊断指标 . 1 3.2 结果
2、判定 . 2 4 综合防治 . 2 4.1 免疫 . 2 4.2 治疗 . 3 4.3 疫情处置 . 3 4.4 生物安全措施 . 3 附录 A（规范性附录） 牛流行热病毒 RT-PCR 检测方法 . 4 DB42/T 11092015 II 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由华中农业大学归口管理。 本标准起草单位：华中农业大学。 本标准协作起草单位：随州市弘大畜牧有限责任公司、湖北省松滋市春珍肉牛养殖场。 本标准起草人： 郭爱珍 、 晁金 、 邓
3、明亮 、 彭清洁 、 胡长敏 、 陈颖钰 、曹永强、周春、 陈焕春 。 DB42/T 11092015 III 引 言 牛流行热（ Bovine ephemeral fever, BEF） ， 又称牛暂时热、三日热 ， 是由牛流行热病毒引起的 一种急性 、 热性 、 蚊媒传播 性 传染病 ， 其特征为 ：发病 突然， 迅速波及全群，病牛 高热 ， 呼吸 急促 ， 流 透明或带泡沫状涎水 ，流泪，运动障碍 ， 妊娠牛 可发生 流产。 该病在 炎热、多雨、蚊 蠓滋 生季节流行 ，是危害湖北省养牛业的重要疫病。由于发病急、传播快， 治疗难度大。 为 有效 预防和控制牛流行热， 特 制定本技术规范，供
4、 湖北省养殖企业 和 养殖户 参照使用。 DB42/T 11092015 1 牛流行热诊断和防治技术规范 1 范围 本规范规定了牛流行热疫情 的诊断 和 综合 防 治 技术 。 本规范适用于 湖北省 牛 养殖企业 和 养殖户对 牛流行热 的诊断和 防治 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是标注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程 3 诊断 3.1 诊断指标 3.1.1 流行病学调查 对发病场进行流行病学调查，根据发病地区、发病对
5、象、发病季节、传播方式、主要症状等，进行 初步诊断。 该病 流行病学特点主要如下： a) 主要侵害牛 ， 黄牛、 奶牛 、水牛均可感染发 病 ，奶 牛、黄牛易感性最大 ， 水牛 易感性较低 ； b) 以 3 岁 5 岁壮年牛 发病最多， 犊牛 和老龄牛 发病 少 ； c) 传染源主要为临床发病牛 ， 发热期病牛血液、呼吸道分泌物及粪便中都带有病毒 ； d) 蚊、蝇、蠓 等 吸血昆虫 经 叮咬传播该病 ； e) 呈 明显季节性，多发于雨量多和气候炎热的 6 月 9 月 ； f) 传播迅速。 3.1.2 临床观察 对发病牛进行临床症状观察，获得进一步的诊断依据。该病的临床症状特点主要如下： a)
6、潜伏期为 3 天 7 天， 发病突然， 迅速 传播 至全 群 ； b) 体温升高到 40 以上，稽留 2 天 3 天 ， 之 后 恢复正常 ； c) 显著流 涎 ，口角有泡沫 ； d) 鼻镜干而热，流鼻液 ； e) 流泪，有水样眼屎，眼睑肿胀，结膜充血 ； f) 呼吸促迫，呼 吸次数可达 80 次 /分 以上， 甚至 因窒息死亡 ； g) 病牛呆立，步态僵硬 (故名 “僵直病 ”)，跛行，严重者后肢麻痹、 站 立困难 、 瘫痪 ； h) 食欲 废绝，反刍停止 ； i) 妊娠母牛可发生流产、死胎 ； j) 泌乳量 下降或泌乳停止。 DB42/T 11092015 2 3.1.3 病理剖检 对病死
7、牛进行病理剖检，重点观察呼吸系统病变，对临床初步诊断进行验证。主要病理变化如下： a） 肺气肿明显， 有 时 伴有肺水肿和充血，气管积有多量泡沫状黏液 ； b） 真胃、小肠和盲肠 可见黏 液增多、 出血 、 黏膜 脱落 等变化 ； c） 肝、脾、肾轻度肿胀 ，有局灶性坏死病变 。 3.1.4 病原学 诊断 病原学诊断是确诊该病的 关键 依据 ，主要有核酸检测和病毒分离鉴定。 3.1.4.1 临床样本的 RT-PCR 检测 a) 模板提取：取病牛发热期肝素钠抗凝血，反复冻融 3次，用病毒 RNA提取试剂盒提取 RNA。 b) RT-PCR： 针对牛流行热病毒 G基因 计设引物，进行 RT-PCR
8、扩增，扩增产物送商业公司测序和分 析。操作方法见附录 A。 3.1.4.2 病毒分离 鉴定 a) 细胞培养：取病牛发热期 肝素钠抗凝血 5 mL 10 mL,反复冻融 3次后， 4离心（ 1000 g） 5 min 后取上清，接种于在 DMEM培养基中（含 10%胎牛血清）长成单层的乳仓鼠肾细胞或非细胞或绿猴肾细胞， 让上清液 铺满细胞单层， 37吸附 1h（其间轻 轻振荡数次），加入含 2%胎牛血清的 DMEM细胞维持液中， 置 37培养 2天 3天，连续观察是否出现细胞病变。若出现病变，则待细胞出现 80%细胞病变时终止培 养，将培养物冻融 3次后，经无菌检验合格后，小管分装（ 1 mL/
9、管）， -70冻存备用，进行 RT-PCR检 测确诊；若未发生细胞病变，盲传 3代，至出现细胞病变；若盲传 3代后仍未出现细胞病变 ,且用 3.1.4.1 方法（ RT-PCR）鉴定为 阴性者，视为阴性；若盲传 3代后仍未出现细胞病变但 RT-PCR鉴定为阳性者视为 阳性，继续传代，直 至出现细胞病变。 b) 动物接种试验：取病牛发 热初期 肝素钠抗凝 血液 5 mL 10 mL， 分离白细胞，取 30 L对 出生 1 日龄 内乳鼠或乳仓鼠脑内接种 （接种 1代）， 每日观察 2次，一般 5天 6天发病，不久死亡。取死鼠脑 制 备 乳剂 （用生理盐水冲洗 3-4次脑组织，然后研磨，用 4层纱布
10、对研磨液进行过滤，滤液即为乳剂），按 以上方法接种乳鼠（接种 2代），连续 3次传 代后 ， 可 100%致死接种乳鼠，然后 取脑组织乳剂 进行 3.1.4.1 描述的 RT-PCR检测，进行确诊 。 3.2 结果判定 对上述检测结果进行如下判断： a) 疑似牛流行热病例 ： 符合该病的流行病学 调查（参见 3.1.1） 和临床 观察（参见 3.1.2） 或 病理 剖检（参见 3.1.3）之一 ，即可定为疑似牛流行热病例。 b) 确诊牛流行热病例 ： 疑似牛流行热病例， 病原学诊断（参见 3.1.4.1和 3.1.4.2） 任何一项阳性， 均 可确诊 为 牛流行热。 4 综合防治 4.1 免疫
11、 每年在蚊蝇 蠓 滋生季节到来前 1.5月 2月， 给牛接种牛流行热疫苗，间隔 3周再以同样剂量加强免 疫 1次 ，接种途径和剂量参照产品说明书。 免疫保护期 6个月。 DB42/T 11092015 3 4.2 治疗 主要进行对症治疗 ，包括退热、缓解呼吸困难、强心、 消炎镇痛、抗菌 措施。 4.3 疫情处置 任 何人如发现 疑似疫情， 应及时向企 业主管 领导和当地 兽医 部门 报告， 并采取隔离、消毒等生物安 全措施 防 止 疫情扩散。 同时， 采样送 相关实验室 进行病原学检测 确诊。 4.4 生物安全措施 4.4.1 消毒 a) 杀 灭 传播媒介 ： 取 2.5%溴氰菊酯（ 敌王 ）
12、乳 剂，按产品使用说明书 稀释 ， 喷洒牛舍 、运动场 和 排粪沟 等环境设施 ，每周两次 ， 杀灭蚊 、 蝇 、蠓等节肢动物 。 b) 环境设施消毒 ： 用商业化消毒剂（ 二氧化氯 、 过氧乙酸 、甲醛等） ， 按产品使用说明书规定浓 度， 对牛舍地面 、 食槽 、 车辆 、对发病或病死动物的排泄物和污染物进行消毒， 以杀灭病毒，减少传染 源。 c) 人员 出入 消毒：对于进 、出 场的人员 ，进行 消毒。 d) 车辆 、工具出入消毒：用商业化消毒剂（ 二氧化氯 、 过氧乙酸 、甲醛等），对出入 车辆 、工具 进行消毒。 4.4.2 无害化处理 病死牛、污染的垫料和饲草等，按 GB 1654
13、8进行无害化处理。 4.4.3 产品处理 a) 发病动物禁止急宰销售。 b) 治疗期间的牛奶和牛肉等牛产品，禁止上市销售。 c) 对于治疗痊愈牛生产的牛奶和牛肉等牛产品，其上市须符合国家对有关药物的休药期规定。 DB42/T 11092015 4 A A 附 录 A （规范性附录） 牛流行热病毒 RT-PCR 检测方法 A.1 引物设计与合成 根据牛流行热病毒（ Bovine ephemeral fever， BEFV）主要免疫保护性糖蛋白 G（ BEFV-G）的保守 核苷酸序列（ GenBank登录号 AF058321）设计引物，序列为： BEFV F（ 5ATTTACAATGTTCCGGT
14、GAA3）（ nt 19 38） BEFV R（ 5GGTATCCATGTTCCGGTTAT3） （ nt 523 542） 引物由商业公司合成。扩增片段大小为 523bp。 A.2 方法 A.2.1 RNA的提取与 反转录合成 cDNA 采集高热期病牛全血 5 mL 10 mL，肝素钠抗凝。 采用病毒 RNA提取试剂盒（ TIANGEN）提取血液的 总 RNA。用反转录试剂盒（ Takara, Japan）进行反转录 （ reverse transcription, RT）成 cDNA。 体系 为： 5 gDNA Eraser buffer 2 L， gDNA Eraser 2 L， RNA
15、 7 L；室温放置 5min；然后加 primeScript RT Enzyme mix 1 L， RT primer mix 1 L， 5 primeScript buffer 21 L， Rnase free H2O 4 L， 总体积 20 L，混合均匀。反 应条件： 37 15 min， 85 5 s， 4 5 min。 A.2.2 PCR PCR反应体系为： cDNA 2 L， LA taq 聚合酶 0.25L， 10 LA buffer 2.5 L， dNTP mixture 2 L， 上下游引物（ F、 R）各 0.5 l，加至 H2O 25 L。 PCR 反应条件为： 95 预变性 4min； 95 变性 1 min， 50 退火 45 s， 72延伸 53 s， 35个循环； 72 延伸 10 min， 16 20 min。 PCR产物 4 保存。 A.3 结果 判断 将 RT-PCR产物在 1%琼脂糖凝胶 上进行 电泳检测，预期 产物 大小 为 523bp，在凝集染色后出现 特 异 性 目的条带。 序列测定后，将获得的产物序列与 GenBank（ GenBank登录号 AF058321） 发表序列比对，相似 性在 99%以上时，确定为 牛流行热病毒。 _
