1、 ICS 11.220 B 41 备案号： DB42 湖北省 地 方 标 准 DB 42/T 1110 2015 牛支原体药物敏感性体外检测操作规程 Technique guideline on drug sensitivity test of Mycoplasma bovis in vitro （报批稿） 2015 - 10 - 30 发布 2015 - 12 - 20 实施 湖北省质量技术监督局 发布 DB42/T 11102015 I 目 次 前 言 . II 引 言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 原理 . 1 5 操作步骤 . 2 5
2、.1 仪器与耗材 . 2 5.2 菌株 . 2 5.3 操作步 骤 . 2 5.4 结果判断 . 3 5.5 实验废弃物的处理 . 3 附录 A（规范性附录） 试剂配制 . 4 附录 B（资料性附录） 牛支原体颜色变化单位测定方法 . 6 附录 C（规范性附录） 药物敏感性判断标准 . 7 参考文献 . 9 DB42/T 11102015 II 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由华中农业大学提出。 本标准由 华中农业大学归 口管理。 本标准起草单位：华中农业大学 。 本标准
3、协作 起草单位： 随州市弘大畜牧有限责任公司、湖北省松滋市春珍肉牛养殖场。 本标准起草人：郭爱珍、 贺 晨飞、 晁金、 陈颖钰 、胡长敏、曹永强、周春、 陈焕春 。 DB42/T 11102015 III 引 言 牛支原体 (Mycoplasma bovis, M. bovis) 是牛的一种重要病原体， 主要导致牛肺炎，也可致乳腺炎、 关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种病症。该病在世界范围内流行。我省于 2008 年在全国首次报道肉牛的牛支原体肺炎，发病率为 50% 100%，病死率高达 10% 50%，给养牛业造成 了巨大的经济损失。 目前牛支原体病的主要控制措施是抗生素
4、治疗。但由于牛支原体无细胞壁，对常用内酰胺酶类抗菌 药不敏感，对其它抗菌药如喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等虽具有一定的敏感性，但治疗周期长， 效疗差，耐药性产生快。因此，体外药物敏感性检测能为临床治疗筛选敏感药物，提高临床治疗效果 ， 同时可用于监测牛支原体耐药性产生的趋势。 然而，目前国内外尚无牛支原体体外药物敏感性检测的技术标准，一定程度上阻碍了该病的有效防 治。为此， 特制定本标准，旨在为我省牛支原体的有效防控提供技术支持，以推动我省养牛业的健康发 展。 DB42/T 11102015 1 牛支原体体外药物敏感性检测操作规程 1 范围 本标准规定了 牛支原体体外药物敏感性检测技术的缩
5、略语、原理和操作 步骤 规程 。 本标准适用于 湖北地区牛支原体临床分离株的药物敏感性分析、 耐药性流行病学调查和 牛 支原体病 的 临床 治疗 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日 期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 18597 危险废物贮存污染 控制标准 DB42/T 1024 牛支原体肺炎检测技术 CLSI M100-S22 抗生素敏感性检测操作标准 Performance standards for antimicro
6、bial susceptibility testing 中华人民共和国国务院令 （ 2003） 第 380号 医疗废物管理条例 3 缩略语 以下缩略语适用于本标准。 3.1 M.bovis 牛支原体 Mycoplasma bovis 3.2 PPLO 胸膜肺炎样微生物 Pleuropnenmonia-like Organism 3.3 MIC 最 低抑菌浓度 Minimum inhibitory concentration 3.4 CCU 颜色变化单位 Color changing unit 3.5 ATCC 美国菌种保藏中心 American Type Culture Collection
7、3.6 CLSI 临床和实验室标准协会 Clinical And Laboratory Standards Institute 4 原理 在液体培养基中，牛支原体生长产酸，将导致培养基颜色改变，由红色变为黄色。当抗生素发生抑 菌或杀菌作用时，因无牛支原体生长，培 养基将维持红色。 抗生素抑制牛支原体生长的强弱以最低抑菌浓度 (MIC)表示，用微量肉汤稀释法测定，具体方法如 下：在 96孔板内依次加入倍比稀释的抗菌药，再加入等体积适当稀释的牛支原体液体培养物，置于 37， DB42/T 11102015 2 5% CO2培养箱中培养 48h，观察每个孔内颜色的变化， 颜色由红色变为黄色表示有牛支
8、原体生长。以不 改变检测管颜色 的 药物最高稀释倍数所 对应的药物浓度 (g/mL)为 MIC。 5 操作步骤 5.1 仪器与耗材 级生物安全柜，二氧化碳培养箱， 96孔细胞培养板，微量可调移液器及枪头， 2 mL一次性无菌 离心管，混匀器，冰箱，天平 ，高压消毒锅， 0.22 m微孔滤膜。 5.2 菌株 标准菌株：美国微生物菌种保藏中心牛支原体参考株 M. bovis PG45（ ATCC 25523）； 临床分离菌株：临床病料分离纯化的菌株，菌株鉴 定 按照 DB42/T 1024中的要求进行 。 5.3 操作步骤 5.3.1 抗菌药溶液配制 根据抗菌药特性，用相应溶剂（如 1 M 氢氧化
9、钠、乙醇或去离子水）将抗菌药溶解，然后用去离 子水将抗菌药稀释成 1 mg/mL的储存液， -80保存。 使用前将储存液用去离 子水稀释至所需工作液浓 度， 4保存备用，各药物贮存液配制方法参照 CLSI M100-S22，见附录 A.1。 去离子水的制备按照 GB/T 6682的要求进行。 5.3.2 菌株复苏鉴定 将保存于 -20含 20%甘油的菌液取出，吸取 100 L菌液接种于 900 L PPLO液体培养基内，置于普 通培养箱中 37培养 48 h 72 h。取 20 L复苏菌液转接于 60 mm PPLO琼脂平板上， PPLO液体和固体培 养基配制见附 录 A.2，置于 37， 5
10、% CO2培养箱中培养 48 h 72 h，在显微镜下标记出形态典型的支原 体单菌落，在超净台内将标记的单菌落挑出，再次接于 PPLO液体培养基内培养，取培养物进行 16S rRNA 通用 PCR和 uvrC特异性 PCR检测，方法见 DB42/T 1024标准的要求 。 5.3.3 牛支原体颜色变化单位测定 将牛支原体用 PPLO液体培养基作 10倍递增稀释，置于普通培养箱中 37 二氧化碳 培养箱中培养 48 h 72 h，观察培养液的颜色变化，以出现颜色变化的最后 1管所对应的牛支原体稀释倍数作为颜色变化 单位，表示为 CCU /mL， 具体操作见 附录 B.1。 5.3.4 最低抑菌浓
11、度 测定 采用微量肉汤稀释法测定牛支原体最低抑菌浓度。在 96孔板内，第 1 9列每孔加入 100 CCU PPLO 液体培养基 pH值 7.6，第 1列加入 工作浓度的抗菌药，混匀后从各孔中取 100 L至第 2列各孔，依次倍比 稀释至第 9列，第 9列弃去 100 L，使每孔体积相同。第 10列各孔加入 100 L PPLO培养基作为牛支原体 生长阳性对照；第 11列各孔加入 200 L pH值 6.8 PPLO培养基呈黄色 作为对照； 12列各孔加入 200 L培 养基作为无菌阴性对照呈红色 。 将复苏和鉴定正确的牛支原体液体培养物按 1:10接种至 PPLO液体培养基中，置于 37，
12、5% CO2培 养箱中培养 24 h， 菌量约为 108 109 CCU/mL后，将菌液稀释至 104倍，备用。第 1 9列各孔加入 100 L 预先稀释好的菌液；第 10列加入 100 L菌液；第 11列和第 12列不加菌液。每株菌做 3个重复。将培养板 用封口膜密封，置于 37， 普通培养箱中培养 48h，在不同时间观察每个孔内颜色的变化并记录，并与 DB42/T 11102015 3 阳性对照第 10列和阴性对照第 12列比较，不发生颜色变化的最低药物浓度为 MIC， 见附录 C图 C.1，然后 计算对应孔的抗菌溶度（ g/mL） 。 . 5.4 结果判断 根据各药物的 MIC值，将牛支
13、原体对药物的敏感性分为敏感 (Susceptible, S)、中度敏感 (Intermediate, I)和耐药（ Resistant, R），判断值参见附录 C表 C.2。当质控菌株对各药物表现敏感时，检测结果有效； 根据临床分离菌株的 MIC值，确定牛支原体临床分离株的药物敏感性种类。 5.5 实验废弃物的处理 含牛支原体的感染性液体和固体废弃物，按医疗废物管理条例进行收集、贮存、消毒和转移。 固体废弃物 121C、 30 min高压消毒处理；液体废弃物收集于含消毒剂的专门容器中， 121C、 30 min高 压消毒处理。 含抗生素的试验废弃物，按 GB 18597标准中的 相关要求进行收
14、 集和贮存，由具有资质的专业机构 进行收集 、转移和处理。 DB42/T 11102015 4 A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 本附录规定了抗菌药工作浓度的配制方法以及 PPLO培养基配制方法，以下试剂除特殊说明外，均 为分析纯。 A.1 抗菌药配制 A.1.1 注意事项 鉴于多种 抗菌 药均为复合盐类，并有纯度标识，配制时，应扣除杂质部分和辅助基团质量，只考虑 纯活性组分的实际浓度。如：含 1个水的盐酸环丙沙星纯度为 98%，分子量为 367.80 g/mol；而环丙沙星 基团的分子量为 331.4 g/mol，校正系数为 331.40/367.80 (98%=0.883)。即称取
15、 5 mg含 1个水的盐酸环 丙沙星时，只相当于 4.415 mg环丙沙星基团（ 5 mg*0.883=4.415 mg）。将 5 mg盐酸环丙 沙星溶于 4.415 mL水中，得到 1 mg/mL的贮存液。 不同抗菌药需要不同的溶剂 溶解。操作时，先用少量合适溶剂溶解，再用去离子水稀释成贮存浓度 为 1mg/mL。 抗菌药溶液定容前，将 pH值调至 7.0，以避免导致牛支原体培养物出现非特异性颜色变化。 所有抗菌药溶液配成贮存浓度后，均 经 0.2 m的微孔滤器过滤除菌。贮存液保存于 -80 备用，工 作液保存于 4备用。 A.1.2 溶剂和稀释液 的配制 参照 CLSI M100-S22
16、配制 ，具体见 表 A.1。 表 A.1 抗菌药贮存液与工作液配制所选择的溶剂和光敏感性 药物类别 药物名称 溶剂 稀释液 贮存液浓度 mg/mL 工作液浓度 g/mL 光敏 感性 喹诺酮类 环丙沙星 Ciprofloxacin 水 水 1 32 是 达氟沙星 Danofloxacin 水 水 1 16 是 恩诺沙星 Enrofloxacin 0.1 M 氢氧化钠 水 1 32 是 马波沙星 Marbofloxacin 水 水 1 64 是 大环内酯类 泰乐菌素 tylosin 水 水 1 32 否 托拉菌素 tulathromycin 0.015 M 柠檬酸 水 5 1024 否 阿奇霉素
17、azithromycin 0.1 M 乙酸 水 1 64 否 地红霉素 Dirithromycin 0.1M 乙酸 水 1 128 否 DB42/T 11102015 5 表 A.1 抗菌药贮存液与工作液配制所选择的溶剂和光敏感性 （续） 药物类别 药物名称 溶剂 稀释液 贮存液浓度 mg/mL 工作液浓度 g/mL 光敏 感性 大环内酯类 罗红霉素 Roxithromycin 95% 乙醇 水 1 64 否 氨基糖苷类 妥布霉素 Tobramycin 水 水 1 64 否 庆大霉素 Gentamicin 水 水 1 256 否 苯丙醇 氟苯尼考 Florfenicol 95% 乙醇 水 1
18、32 否 甲砜霉素 Thiamphenicol 95% 乙醇 水 3 512 是 四环素类 四环素 Tetracycline 水 水 1 16 是 多西环素 Doxycycline 水 水 1 32 是 金霉素 Chlortetracycline 0.01 M 盐酸 水 1 64 是 林可胺酰胺类 林可霉素 Lincomycin 水 水 1 32 否 甘氨酰环素 替加 环素 Tigecycline 水 水 1 128 否 A.2 PPLO培养基配制 PPLO 10.5 g，酵母粉 2.5 g，琼脂粉 7.5 g （ 仅固体培养基加 ） ，丙酮酸钠 0.5 g，超纯水定容至 445 mL， 11
19、5灭菌高压灭菌 20 min后，待温度降至 50以下时，加入马血清 50 mL，无菌 10 MEM 5 mL，无菌 40万单位 /mL青霉素溶液 1 mL，无菌 1%酚红溶液 500 L（仅液体培养基加） ， pH 值 7.6。 DB42/T 11102015 6 A B 附 录 B （资料性附录） 牛支原体颜色变化单位测定方法 B.1 牛支原体颜色变化单位的测定 取 12支 1.5 mL的 EP管，每管加入 900 L的 PPLO液体培养基，然后在第 1管中加入 100 L已复苏的待 测菌液，充分混匀后，吸取 100 L加入第管，混匀，再吸取 100 L加入第 3管，依此类推，到最后 1 管
20、。置于 普通培养箱 中 37培养 48 h 72 h，观察培养液的颜色变化，以最后出现颜色变化的 1管为判定 标准，即如果第 5管为最后发生颜色变化管，则颜色变化单位为 105 ccu/mL。 DB42/T 11102015 7 B C 附 录 C （规范性附录） 药物敏感性判断标准 C.1 药物 MIC检测 采用微量肉汤稀释法测定牛支原体 MIC。在 96孔板内依次加入倍比稀释 的抗菌药，再加入等体积适 当稀释的牛支原体液培养物，置于 37普通培养箱中培养 48 h，观察每个孔内颜色的变化并记录，不改 变颜色（图 C.1）的药物最高稀释倍数对应管的抗菌药浓度（ g/mL）即为 MIC。 图
21、C.1 微量肉汤稀释法测定牛支原体最低抑菌浓度 注： 第 1-9 列为加 2 倍递增稀释的抗菌药物，第 10 列为未加药物的牛支原体生长阳性对照（黄色）列为 pH6.8 培 养基颜色对照（黄色），第 12 列为未加药物和菌的培养基颜色对照（红色）。 C.2 药物敏感性判断标准 根据 MIC值将牛支原体对所测药物的敏感性分为敏感 (Susceptible, S)、中度敏感 (Intermediate, I)和耐 药（ Resistant, R）。各药物的具体判断值见 表 C.1。 DB42/T 11102015 8 表 C.1 牛支原体对各种药物敏感性判断值 药物类别 药物名称 药物浓度（ g
22、/mL） 敏感 中介 耐药 喹诺酮类 环丙沙星 Ciprofloxacin 1 2 4a 达氟沙星 Danofloxacin 1 2 4 8a 恩诺沙星 Enrofloxacin 1 2 4 8a 马波沙星 Marbofloxacin 1 2 4 头孢菌素类 头孢喹肟 Cefquinome 8 16 32 大环内酯类 泰乐菌素 tylosin tartrate 0.5 1 4 8 托拉菌素 tulathromycin A 16 32 64 阿奇霉素 azithromycin 2 4 8 地红霉素 Dirithromycin 2 - 8 罗红霉素 Roxithromycin 2 4 8 氨基糖苷
23、类 妥布霉素 Tobramycin 4 8 16a 庆大霉素 Gentamicin 4 8 16 苯丙醇 氟苯尼考 Florfenicol 2 4 8 甲砜霉素 Thiamphenicol 8 16 32 四环素类 四环素 Tetracycline 4 8 16a 多西环素 Doxycycline 4 8 16a 金霉素 Chlortetracycline 4 8 16 林可胺类 林可霉素 Lincomycin 2 - 4 甘氨酰环素 替加环素 Tigecycline 2 - 8 a CLSI M100-S22 苛养菌标准； b 达氟沙星与恩诺沙星的判断标准引自于 Ter Laak et al
24、., 1992a, b;1993，其它药物的判断标准均来自于 CLSI M100-S22。 DB42/T 11102015 9 参 考 文 献 1 Ter Laak, E.A., Noordergraaf, J.H., Dieltjes, R.P.J.W. Prevalence of mycoplasmas in the respiratory Tracts of pneumonic calves. Journal of Veterinary Medicine. Series B, 1992a, 39(8), 553562. 2 Ter Laak, E.A., Noordergraaf, J.
25、H., Boomsluiter, E. The nasal mycoplasmal ora of healthy calves and 1 cows. Journal of Veterinary Medicine. Series B, 1992b, 39(8), 610616. 3 Ter Laak, E.A., Noordergraaf, J.H., Verschure, M.H. Susceptibilities of Mycoplasma bovis, Mycoplasma dispar and Ureaplasma diversum strains to antimicrobial agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1993, 37(2), 317321. _
