1、ICS 65.120 B 46 DB41 河南省 地方标准 DB41/T 1903 2019 饲料添加剂 粪肠球菌 2019 - 09 - 30发布 2019 - 12 - 30实施 河南省市场监督管理局 发布 DB41/T 1903 2019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 技术要求 . 1 4 试验方法 . 2 5 检验规则 . 3 6 标签、包装、运输与贮存 . 4 7 保质期 . 4 附录 A（规范性附录） 粪肠球菌的测定 . 5 DB41/T 1903 2019 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准
2、由河南省农业农村厅提出并归口。 本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、河南省乘风动物保健技术研究所、洛阳欧克拜克生 物技 术股份有限公司、河南智盛优品生物科技有限公司。 本标准主要起草人：郭芙蓉、杨灵杰、廖建伟、段伟凯、田艳飞、吴贺伟、王伟伟、杨顺强。 DB41/T 1903 2019 1 饲料添加剂 粪肠球菌 1 范围 本标准 规定了 饲料添加剂 粪肠球菌 （ Enterococcus faecalis） 的 技术要求、试验方法、检验规 则、标签、包装、运输与贮存 。 本标准适用于 以粪肠肠球菌为菌种经扩增、 发酵 、离心、 干燥 制得的饲料添加剂。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的
3、应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最 新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.3 食品微生物学检验 大肠菌群计数 GB 4789.5 食品微生物学检验 志贺氏菌检验 GB 4789.10 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5917.1 饲料粉碎粒度测定 两层筛筛分法 GB/T 6435 饲料中水分的测定 GB 10648 饲料标签 GB/T 13079 饲料中总砷的测定 GB/T 13080 饲料中铅的测定 原子吸收光谱法 GB/T 13081 饲料中汞的测定 GB/T 13082 饲料中镉的测定方法
4、 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检验方法 GB/T 13092 饲料中霉菌总数的测定 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 17480 饲料中黄曲霉毒素 B1的测定 酶联免疫吸附法 GB/T 18823 饲料检测结果判定的允许误差 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 NY/T 1444 微生物饲料添加剂技术通则 定量包装商品计量监督管理办法中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局令（ 2005）第 75 号 饲料原料目录 中华人民共和国农业部公告第 1773号 饲料添加剂品种目录（ 2013）中华人民共和国农业部公告第 2045号 3 技术要求 3.1 原料 应符合饲料
5、添加剂品种目录（ 2013）和饲料原料目录的规定。 DB41/T 1903 2019 2 3.2 感官 粉状，色泽一致，无霉变和结块，有发酵的酸香（特殊气）味。 3.3 成品粒度 全部通过 2.00 mm编织筛， 1.50mm分析筛筛上物不大于 10%。 3.4 水分 水分应不大于 12.0%。 3.5 理化指标 理化指标应符合表 1的规定。 表 1 理化指标 项目 指标 粪肠球菌活菌数 /CFU/g 1.00 109 砷（以总砷计）的允许量 /mg/kg 2 铅（以 Pb计）的允许量 /mg/kg 20 汞（以 Hg计）的允许量 /mg/kg 0.1 镉（以 Cd计）的允许量 /mg/kg
6、1 大肠菌群的允许量 /个 /kg 1 105 霉菌总数的允许量 /个 /kg 2 107 黄曲霉毒素 B1/g/kg 30 沙门氏菌的允许量 /（ 25g中） 不得检出 志贺氏菌 不得检出 金黄色葡萄球菌 不得检出 4 试验方法 4.1 感官 取适量样品，在非阳光直射条件下，观其色泽、形态、嗅其气味。 4.2 成品粒度 按 GB/T 5917.1的规定执行。 4.3 水分 按 GB/T 6435的规定执行。 4.4 粪肠球菌活菌数 按附录 A的规定执行。 4.5 砷 DB41/T 1903 2019 3 按 GB/T 13079的规定执行。 4.6 铅 按 GB/T 13080的规定执行。
7、4.7 汞 按 GB/T 13081的规定执行。 4.8 镉 按 GB/T 13082的规定执行。 4.9 大肠菌群 按 GB 4789.3的规定执行。 4.10 霉菌总数 按 GB/T 13092的规定执行。 4.11 黄曲霉毒素 B1 按 GB/T 17480的规定执行。 4.12 沙门氏菌 按 GB/T 13091的规定执行。 4.13 志贺氏菌 按 GB 4789.5的规定执行。 4.14 金黄色葡萄球菌 按 GB 4789.10的规定执行。 5 检验规则 5.1 检验批次 同一配方、同一发酵周期生产的产品为一个检验批次。 5.2 采样 按 GB/T 14699.1的规定执行。 5.3
8、 试样制备 按 GB/T 20195的规定执行。 5.4 出厂检验 5.4.1 检验项目 DB41/T 1903 2019 4 感官、成品粒度、水分、粪肠球菌活菌数。 5.4.2 判定规则 以本标准的有关试验方法要求为依据，对抽取样品按出厂检验项目进行检验，检验结果中如有一项 指标不符合标准要求时，应重新加倍抽样进行复检，复检结果如仍有一项指标不符合本标准要求，则该 批产品不合格。各项成分指标判定合格或验收的界限按 GB/T 18823规定执行，微生物指标粪肠球菌不低 于 5%。 5.5 型式检验 5.5.1 检验 条件 有下列情况之一，应进行型式检验： a) 改变生产工艺； b) 正常生产每
9、年至少进行一次； c) 停产半年后再恢复生产时。 5.5.2 检验项目 第 3章规定的内容。 5.5.3 判定规则 以本标准的有关试验方法和要求为依据。检验结果中如有一项指标不符合标准要求时，应重新加倍 抽样进行复检，复检结果如仍有一项指标不符合本标准要求，则该周期产品不合格。各项成分指标判定 合格或验收的界限依据 GB/T 18823执行。微生物指标不得复检。如型式检验不合格，应停止生产至查明 原因。 6 标签、包装、运输与贮存 6.1 标签 按 GB 10648的规定执行。 6.2 包装 包装材料应 符合国家有关安全卫生要求。净含量的允许短缺量应符合定量包装商品计量监督管理 办法的规定。
10、6.3 运输与贮存 运输途中应有遮盖物，并防止雨淋。不应与有毒、有害、有辐射等物品混装、混运。应贮存在通风、 干燥、阴凉、无污染的库房内，避免阳光直晒。 7 保质期 在上述规定的包装贮存条件下，自生产之日起，原包装产品的保质期 12个月。 DB41/T 1903 2019 5 A A 附 录 A （规范性附录） 粪肠球菌的测定 A.1 原理 每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌 落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应的单位或活菌数。 A.2 菌种鉴别 A.2.1 形态特征 粪肠球菌在 MRS培养基（ A.3.1）上菌落生长形态特征见表 2 表
11、2 粪肠球菌在 MRS培养基上的菌落特征 菌种类型 菌落特征 乳酸菌 菌落较小，白色或乳白色菌落，表面光滑，边缘整齐，直径为 2-4mm。 A.2.2 培养特征 细菌呈球状、卵圆状， 0.5 m 0.8 m，单个、成对或短链状排列。 A.2.3 生理生化特征 粪肠球菌菌落为圆形，菌落较小，白色或乳白色菌落，表面光滑，边缘整齐，直径为 2-4mm。能在 6.5%氯化钠、 pH9.6碱性环境及 45生长 ，能分解葡萄糖产酸不产气，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖， 硝酸盐还原阴性， 最适生长温度 36 、 60 min 。粪肠球菌生理化特征见表 3 表 3 粪肠球菌生理生化特征 项目 粪肠球菌 6.5%
12、氯化钠 pH9.6 45生长 葡萄糖 产酸 葡萄糖 产气 山梨醇 阿拉伯糖 硝酸盐还原 36 、 60 min 注： ：阳性反应；：阴性反应 A.3 粪肠球菌培养与计数 DB41/T 1903 2019 6 A.3.1 MRS培养基的配制 分别称取蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母浸粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、醋酸钠 5.0 g、磷酸氢二 钾 2.0 g、硫酸镁 0.5 g、硫酸锰 0.2 g、柠 檬酸三铵 2.0 g、 TW-80 1.0 g、琼脂 15 g加入 1000ml蒸馏水 中，加热至溶解， pH6.6 0.2，分装， 121 高压灭菌 15 min备用。 A
13、.3.2 样品制备与稀释 以无菌操作称取被检样品 25 g，加入装有 225 mL无菌生理盐水的三角瓶中（瓶内先放置约二十粒玻 璃珠），充分振动 30 min。制成 1:10（即 10-1）的均匀稀释液。 用 1 mL吸管吸取 10-1稀释液 1 mL，慢慢注入含有 9 mL无菌生理盐水的小三角瓶或试管，并振动三角 瓶或试管，制成 10-2的均匀稀释液。 上述操作继续稀释，每次 10倍， 分别制成 10-3， 10-4 10-n的均匀稀释液。 A.3.3 培养 倾注法：先对被检样品所含菌体数进行估计，选择三个稀释度，每个稀释度分别取 1 mL，注入三个 平皿中。每个平皿 1 mL，每个稀释度做
14、三个平皿。及时将保温至 45 50 的培养基倒入平皿（每个 平皿约 15 mL），并轻轻摇动平皿使培养基和菌液混合均匀，待琼脂凝固后，将平皿倒置于 37 培养箱 24 h，即可计算平皿内菌落总数。 涂布法：先对被检样品所含菌体数进行估计，选择三个稀释度， 预先准备好可用的 MRS培养基平板 9 块， 吸取三 个梯度稀释液各 100 L至 平板中涂布均匀 ， 每个梯度 3块平板， 倒置 平板 于 37 培养箱培养 2436h，即可计算平皿内的菌落总数。 A.3.4 菌落计数 以平板上出现 30个 300个菌落数的稀释度平板为计数标准。 当只有一个稀释度，其平均菌落数在 30 300时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。 若有连个稀释度，其平均菌落数在 30 300时，应按两者菌落总数比值来定。若其比例小于 2,应计 数两者的平均数，若大于 2则计数其中稀释度较小的菌落总数。 若三个稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。 若三个稀释度的平均菌落数均 小于 300，则应按稀释度最低的菌落平均数乘以稀释倍数。 若三个稀释度的平均菌落数均不在 30 300，则应以最接近的平均菌落数乘稀释倍数。 A.3.5 计算公式 统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数。 目标菌落数按照下列公式计算： 样品的活菌数（ CFU/g）菌落平均数 稀释倍数。 _
