1、ICS 65.120 B 05 DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB 41/T 1729 2018 饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定 分光光度法 2018 - 11 - 26发布 2019 - 02 - 26实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 1729 2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局提出并归口。 本标准起草单位 :河南海瑞正检测技术有限公司、河南牧业经济学院、 河南省粮油饲料产品质量监 督检 验中心、 河南省兽药饲料监察所、 河南省粮油科学研究所有限公司 。 本标准主要起草人 :李贤、曹明月、文英会、侯林丛、高海
2、军、魏广辉、谭旭信、刘文杰、周江滨、 王莉莉 。 DB41/T 1729 2018 1 饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力的测定 分光光度法 1 范围 本标准规定了 测定饲料添加剂葡萄糖氧化酶活力 的 分光光度方法 。 本标准适用于饲料添加剂、混合型饲料添加剂 及其复合酶 。 本方法的定 量限为 60 U/g。 2 规范性引用文件 下 列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的 修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 葡萄糖
3、氧化酶活力 在 30 、 pH为 6.0 的条件下，每分钟能把 1 mol 的葡萄糖氧化成 -D-葡萄糖酸和过氧化氢所需 的酶量，定义为一个葡萄糖氧化酶活力单位 （ U） 。 4 原理 在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖发生氧化反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢与无色的还 原型 4-氨基安替比林和苯酚在辣根过氧化物酶的催化作用下，生成红色的醌亚胺，生成醌亚胺的量与 反应液中葡萄糖氧化酶的活力成正比。通过分 光光度计比色测定反应液的吸光度，计算出葡萄糖氧化酶 的活力。 5 试剂或材料 5.1 磷酸缓冲溶液（ pH 6.0） :分别称取 12.1 g 一水磷酸二氢钠和 2.189 g（精确至 0.
4、001 g）二水 磷酸氢二钠，加入约 800 mL 水，完全溶解后调节 pH 为 6.0 0.02，定容至 1 000 mL。 5.2 葡萄糖溶液（ 180 g/ L） :称取 18.0 g 无水葡萄糖，用磷酸缓冲液（ 5.1）溶解，定容至 100 mL。 5.3 4-氨基安替比林溶液（ 50 g/ L） :称取 5 g 4-氨基安替比林（精确至 0.001 g），加水溶解 ，定 容至 100 mL ，棕色试剂瓶存放。 5.4 苯酚溶液（ 11 g/ L） :称取 1.1 g 苯酚（精确至 0.001 g），加水溶解，定容至 100 mL。 5.5 辣根过氧化物酶（ HRP）液 :称取 0.0
5、015 g（ 精确至 0.000 1 g）辣根过氧化物酶于 5 mL 离心管 中，加入 3 mL 水溶解，备用。 注： 除非另有说明，试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 中规定的三级水。 6 仪器设备 DB41/T 1729 2018 2 6.1 分样筛 :孔径为 0.25 mm。 6.2 分析天平 :感量 0.1 mg。 6.3 pH 计 :精度为 0.01。 6.4 磁力搅拌器 :附加热功能。 6.5 恒温水浴锅 :30 。 6.6 秒表 :每小时误差不超过 5 s。 6.7 分光光度计 :吸光度 500 nm。 6.8 离心机 :离心力不低于为 2 000 g。 7 试验步骤 7.
6、1 试样酶液的制备 固态试样应粉碎或充分碾碎，过 0.25 mm 孔径筛。称取 1 g 试样两份，精确至 0.000 1 g，分别置 于 200 mL 锥形瓶中，加入 50 mL 磷酸缓冲溶液（ 5.1）。摇床或磁力搅拌提取 30 min，上离心机 4000 r/min 离心 5 min，取上清液，上清液再用缓冲溶液（ 5.1）做二次稀释，使稀释后的待测酶液中葡糖糖氧化酶 活力控制在 6 U/mL 10 U/mL 之间。 7.2 测定 取 3支试管，分别移取 0.2 mL 辣根过氧化物酶液（ 5.5），加入 4 mL 磷酸缓冲液 （ 5.1），振摇 3 s， 加入 0.6 mL 葡萄糖溶液 （
7、 5.2），振摇 3 s，加入 0.8 mL 苯酚溶液 （ 5.4），振摇 3 s，再加入 0.2 mL 4- 氨基安替比林溶液 （ 5.3），振荡混匀。 30 0.2 水浴 5 min，取出。 向其中 1支试管中加入 0.2 mL 水，作为空白调零。 向另外 2支试管中加入 0.2 mL 试样溶液，振荡混合，立即用 1 cm 比色皿，在 500 nm 处测定吸 光度 为 A0，再准确反应 1 min 后，读取吸光度值 A1 ，得出 A=A1-A0。 8 试验数据处理 试样稀释液中葡萄糖氧化酶活力以 X0 表示，单位为酶活力单位每毫 升 （ U/mL） ，按式（ 1）计算 : 10008870
8、 dAt BfAX （ 1） 式中 : f 酶液稀释倍数； B 反应液体积 （ mL） ； t 酶解反应时 间，单位为分 （ min） ； A 加入样品体 积 （ mL） ； d 比色皿的厚度 （ cm） ； 887 消光系 数 （ LmoL -1cm -1） ； X0 值应 在 6 U/mL 10 U/mL之 间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测 定。 试样葡萄糖氧化酶的活力以 X 表示，单位为酶活力单位每克（ U/g）或者酶活力单位 每毫升（ U/mL） ， 按式（ 2）计算 : nXX 0 （ 2） DB41/T 1729 2018 3 式中 : X0 试样稀释样中 葡萄糖氧化酶 活力，单位为酶活力单位每毫升 （ U/mL） ； n 试样的总稀释倍数； 计算结果保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下，两次独立测定结果的相对误差不超 过 8%。 _
