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    DB41 T 1587-2018 饲料中大肠杆菌O157的检测 EMA-PCR法.pdf

    • 资源ID:1486156       资源大小:424.04KB        全文页数:10页
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    DB41 T 1587-2018 饲料中大肠杆菌O157的检测 EMA-PCR法.pdf

    1、ICS 65.120 B 46 DB41 河南省地方标准 DB41/T 15872018 饲料中大肠杆菌 O157 的检测 EMA-PCR 法 2018 - 04 - 17 发布 2018 - 07 - 17 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 15872018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局提出并归口。 本标准起草单位:河南省兽药饲料监察所、郑州大学。 本标准主要起草人:方忠意、高延玲、李金磊、赵全成、陈小鸽、孟伟、魏法山。 本标准参加起草人:董鹏、狄元冉、陈蔷、张艳娜、赵林萍、曾萍、张宁、王庆东、郑彬、李博、 彭丽、张磊。

    2、DB41/T 15872018 1 饲料中大肠杆菌 O157 的检测 EMA-PCR 法 1 范围 本标准规定了饲料中大肠杆菌 O157 的 EMA-PCR 检测方法。 本标准适用于饲料中大肠杆菌 O157 的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 3 原理 叠氮溴化乙锭(EMA)

    3、能够透过死细菌的细胞膜,在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合,使 死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增,而活菌能进行PCR扩增。 4 试剂和材料 4.1 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂,试验用水符合 GB/T 6682 一级水的要求。 4.2 营养肉汤:见附录 A 的 A.1。 4.3 肠道增菌肉汤:见附录 A 的 A.2。 4.4 2Premix Taq 缓冲液:内含 Taq DNA 聚合酶 1.25 U/25 L,4 mmol Mg 2+ ,dNTP 各 0.4 mmol。 4.5 特异性引物(对) 序列为: a)上游引物:5-CAG GTG AAG GTG GAA TGG

    4、TTG T-3; b)下游引物:5-CTC TT T CCT CTG CGG TCC TAG TTA-3。 4.6 琼脂糖:电泳级。 4.7 Marker 2000。 4.8 大肠杆菌 O157 CIC C 21530。 4.9 50TAE 缓冲液:见附录 A 的 A.3。 4.10 6上样缓冲液:见附录 A 的 A.4。 4.11 叠氮溴化乙锭(EMA,0.2 mg/mL):见附录 A 的 A.5。 4.12 溴化乙锭(10 mg/mL)。 4.13 灭菌离心管:1.5 mL,15 mL。 5 仪器设备 DB41/T 15872018 2 5.1 PCR 仪。 5.2 电子天平:感量 0.0

    5、1 g。 5.3 电热恒温培养箱。 5.4 离心机:转速12 000 r/min。 5.5 浊度仪。 5.6 卤素灯:照度25 000 勒克斯(Lux)。 5.7 核酸电泳仪。 5.8 凝胶成像系统。 5.9 微量移液器:0.5 L10 L,10 L100 L,100 L1000 L,1 mL10 mL。 5.10 涡旋仪。 6 样品采集与制备 按GB/T 14699.1的规定采样,将样品充分混匀后密封低温保存,整个过程避免人为污染。 7 检验步骤 7.1 增菌 取25 g试样于225 mL 营养肉汤(4.2)中,充分混匀,36 1 培养6 h进行预增菌,取10 L预增 菌液转移至10 mL肠

    6、道增菌肉汤(4.3)中,42 1 培养18 h。如果试样量不足25 g,试样质量与增菌 液的体积比应为19。 7.2 模板的制备 取1 mL增菌液至离心管中, 12 000 r/min离心2 min, 弃上清。 加入1 mL灭菌水悬浮沉淀物, 12 000 r/min 离心2 min,弃上清,重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦氏单位(MCF)。 取0.2 mL菌悬液至离心管中,加入2 L EMA溶液(4.11)混匀,避光孵育5 min。将离心管开盖置于冰上, 卤素灯照射下曝光2 min,然后水浴煮沸10 min,再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却。涡旋混匀裂解 物,

    7、12 000 r/min离心2 min,收集上清液,作为PCR扩增的模板(模板制备可选用等效的商品化试剂盒)。 检测过程中分别设阳性对照和阴性对照,用添加大肠杆菌O157阳性标准菌株的样品作为阳性对照,用不 含大肠杆菌O157的样品作为阴性对照。 7.3 PCR 扩增 采用50 L反应体系:2Premix Taq缓冲液(4.4)25 L,模板5 L,浓度为20 mol/L的上、下 游引物各1 L,灭菌水18 L。 反应程序为:95 预变性5 min;35个循环:95 变性30 s,60 退火30 s,72 延伸40 s;72 终 延伸5 min后4 保存。 7.4 电泳检测 PCR 扩增产物

    8、称取1.5 g琼脂糖(4.6)加入100 mL 1TAE电泳缓冲液(4.9)中,加热使其充分熔化,冷至65 左右,加入5 L溴化乙锭(4.12),充分混匀,根据需要在模板内放入合适的梳子,倒入凝胶制成约 5 mm厚的胶块。 在电泳槽中加入适量1TAE缓冲液, 使液面没过凝胶2 mm左右。 取PCR扩增产物5 L8 L DB41/T 15872018 3 与1 L 6上样缓冲液(4.10)混合后加入到上样孔内,设Marker 2000(4.7)对照。5 V/cm8 V/cm 恒压下电泳20 min30 min。 电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果。 8 结果判定 8.1 结果分析条

    9、件设定 如果大肠杆菌O157阳性对照的PCR产物在318 bp处出现条带(参见附录B),同时阴性对照PCR产物 于318 bp处未出现条带,则检测结果成立;否则结果无效,应重新进行检测。 8.2 阳性判定 样品的PCR产物电泳后在318 bp处出现条带,则为疑似阳性样品,此时需按GB 4789.6进行确证,最 终结果以后者检测结果为准。 8.3 阴性判定 样品的PCR产物电泳后在318 bp处未出现条带,判定25 g样品中未检出大肠杆菌O157。 DB41/T 15872018 4 A A 附 录 A (规范性附录) 培养基和试剂 A.1 营养肉汤 A.1.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉

    10、膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 水 1 000 mL A.1.2 制法 将以上成分混合加热溶解, 冷却至25 左右调节至pH7.40.2, 分装适当的容器。 121 灭菌15 min。 A.2 肠道增菌肉汤 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 葡萄糖 5.0 g 牛胆盐 20.0 g 磷酸氢二钠 8.0 g 磷酸二氢钾 2.0 g 煌绿 0.015 g 水 1 000 mL A.2.2 制法 将以上成分混合加热溶解,冷却至25 左右调节至pH7.40.2,分装每管10 mL。115 灭菌20 min。 A.3 50TAE电泳缓冲液 A.3.1 成分 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 242

    11、.0 g 乙二胺四乙酸二钠(Na 2EDTA 2 H2O) 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 灭菌水 942.9 mL A.3.2 制法 DB41/T 15872018 5 Tris和乙二胺四乙酸二钠溶于800 mL灭菌水, 充分搅拌均匀; 加入冰乙酸, 充分溶解; 用1 mol/L NaOH 调节至pH8.3,定容至1 L后,室温保存。使用时稀释50倍即为1TAE电泳缓冲液。 A.4 6上样缓冲液 A.4.1 成分 溴酚蓝 0.5 g 二甲苯氰FF 0.5 g 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA,pH 8.0) 0.06 mL 甘油 360 mL 灭菌水 640 mL A.4.2

    12、制法 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)溶于500 mL灭菌水中,加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解,与甘油混合,定容 至1 000 mL,分装后4 保存。 A.5 叠氮溴化乙锭(EMA) A.5.1 成分 叠氮溴化乙锭 5 mg 灭菌水 25 mL A.5.2 制法 5 mg叠氮溴化乙锭溶于5 mL灭菌水中,定容至25 mL,充分混匀,分装后-20 避光保存。 DB41/T 15872018 6 B B 附 录 B (资料性附录) 大肠杆菌 O157 活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 大肠杆菌O157活菌EMA-PCR扩增电泳图参见图B.1。 说明: MMarker 2000; 1阴性对照; 2阳性对照。 图B.1 大肠杆菌 O157 活菌 EMA-PCR 扩增电泳图 _


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