1、ICS 65.120 B 20 DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB 41/T 1728 2018 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法 2018 - 11 - 26发布 2019 - 02 - 26实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 1728 2018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由河南省畜牧局提出并归口。 本标准起草单位 :河南海瑞正检测技术有限公司、 河南省兽药饲料监察所、 河南省种牛遗传性能测 定中心。 本标准主要起草人 :朱慧慧、陆静、方忠意、李灵平、周永亮、黄好强、麻晓燕、王洋洋、范晓燕、 魏金销 。 DB41/T 1728
2、 2018 1 饲料添加剂丁酸梭菌的测定 微生物法 1 范围 本标准规定了饲料添加剂丁酸梭菌的检测方法 微生物法。 本标准适用于饲料及饲料添加剂中丁酸梭菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定 3 培养基或材料 3.1 亚硫酸铁琼脂培养基 :见附录 A中 A.1。 3.2 0.85%生理盐水 :见附录 A中 A.2。 3.3 产酸指示培养基
3、:见附录 B中 B.1。 3.4 明胶培养基。 3.5 淀粉水解培养基。 3.6 革兰氏染色配套试剂 :见附录 A中 A.3。 3.7 胰蛋白胨大豆琼脂 (TSW)。 注： 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。水 应符合 GB/T 6682中三级水的要求。 4 仪器设备 4.1 天平 :感量 0.01 g。 4.2 粉碎机。 4.3 高压灭菌器。 4.4 恒温培养箱。 4.5 电热鼓风干燥箱。 4.6 拍击式匀质器。 4.7 厌氧罐（配厌氧产气袋）。 4.8 超净 工作台。 4.9 移液器 :100 L 1 000 L。 4.10 显微镜。 4.11 酒精灯。 4.12 试管架。
4、4.13 灭菌试管 :15 mL。 4.14 灭菌平皿 :直径 90 mm。 DB41/T 1728 2018 2 5 测定步骤 5.1 试样稀释及培养 5.1.1 无菌条件下称取试样 25 g(mL)样品，加入装有 225 mL 0.85%灭菌生理盐水的匀质袋中，然后用 匀质器拍打 2 min 3 min，制成 1:10的均匀稀释液。 5.1.2 用移液器移取 1:10稀释液 1 mL，注入含有 9 mL 0.85%灭菌生理盐水的试管中，充分混匀后， 制成 1:100的稀释液。 5.1.3 按上述操作方法， 10倍递增稀释，如此每递增稀释一次。 5.1.4 选择 2 3个适宜稀释度，用移液器
5、移取 1 mL 稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿， 同时用 1 mL无菌生理盐水作对照 。然后将凉至 50 左右的培养基注入平皿中，小心转动培养基使试 样与培养基充分混匀。 5.1.5 待培养基凝固后迅速将平皿倒置于培养箱中， 37 厌氧培养 18 h 24 h，观察菌落形态。 5.2 菌落特征 亚硫酸铁琼脂培养基上， 菌落圆形，较小、规则、 实心，刚开始为黑色，放置 1 d 2 d 时间黑色 褪为白色。 5.3 确证试验 从平皿中选出 5 个特征菌落进行确证试验，在胰蛋白胨大豆琼脂平皿上进行纯化。挑选纯化的菌 落做革兰氏 染色和生化试验，生化试验项目如表 1。 确证结果 :革兰氏染色
6、为阳性菌，菌体呈杆状，能形成圆形或椭圆形芽孢，菌体中部膨大呈梭形。 生化试验不水解明胶，水解淀粉，可以利用蜜二糖和葡萄糖产酸，不利用松三糖，鼠李糖和山梨醇， 即可判定为丁酸梭菌。 表 1 生化鉴定 项目 明胶液化 淀粉水解 蜜二糖 松三糖 鼠李糖 山梨糖 葡萄糖 结果 - + + - - - + 注： -:阴性； +:阳性 6 结果计算与报告 6.1 计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数 a，使用式（ 1）计算 : CAba （ 1） 式中 : a-计算每块平板上的丁酸梭菌菌落数； b-挑选后经证实为丁酸梭菌的菌落数； A-挑选平板上用于验证的菌落数； C-平板上的所有特征菌落数。 最终结果按照 G
7、B/T 8170 数值修约规则修约至整数。 DB41/T 1728 2018 3 6.2 样品中丁酸梭菌数的计算方法与报告 选择两个连续稀释度平板（ 每个稀释度至少有一块平板），其上经确证后的丁酸梭菌数介于 30 300之间，通过式（ 2）计算，即为 1 mL 或 1 g 样品中的丁酸梭菌菌数 N: dnn aN )1.0( 21 （ 2） 式中 : N 样品中丁酸梭菌菌数； a 所有平板经确证后的丁酸梭菌菌数的总和 ； n1 第一个稀释的平均数； n2 第二个稀释的平均数； d 第一个稀释度的稀释因子（未经稀释的液体样品的 d 值为 1）。 按照 GB/T 8170数值修约规则将计算出的结果
8、保留两位有效数字，也可将样品的丁酸梭菌菌落数记 录为 1.0 9.9 乘以 10 的指数幂表示。 DB41/T 1728 2018 4 附 录 A （资料性附录） 培养基和试剂 A.1 硫酸亚铁培养基 A.1.1 成分 胰蛋白胨 15.0 g 大豆蛋白胨 5.0 g 酵母粉 5.0 g 偏重亚硫酸钠 1.0 g 柠檬酸铁铵 1.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.1.2 制法 将上述成分置于烧杯中加热溶解，分装于三角瓶中； 121 高压 灭菌 15 min。 A.2 0.85%生理盐水 称取氯化钠（分析纯） 8.5 g，溶于 1 000 mL蒸馏瓶中。 分装于三角瓶中 ，
9、 121 高压灭菌 15 min。 A.3 革兰氏染色 A.3.1 结晶紫染色液 A.3.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95%乙醇 20 mL 1%草酸氨溶液 80 mL A.3.1.2 制法 将结晶紫溶解于乙醇中，然后 与草酸铵溶液混合 。 A.3.2 革兰氏碘液 A.3.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.3.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合， 加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL。 DB41/T 1728 2018 5 A.3.3 沙黄复染液 A.3.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10 mL 蒸
10、馏水 90 mL A.3.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，用蒸馏水稀释。 DB41/T 1728 2018 6 附 录 B （规范性附录） 培养基和试剂 B.1 产酸指示培养基 B.1.1 成分 磷酸氢二铵 1.0 g 氯化钾 0.2 g 硫酸镁 0.2 g 酵母膏 0.2 g 0.04%溴甲酚紫 15 mL 琼脂 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL B.1.2 制法 除溴 甲酚紫外，其余成分溶解于水，加入所需用糖，必要时可加热溶解，调节 pH 至 7.0 左右， 加入指示剂溴甲酚紫，分装于试管， 115 高压 灭菌 30 min。 试验方法 :挑取培物接种于上述培养基中， 36 培养 2 d 5 d，观察指示剂变黄，表示产酸，为 阳性；不变或变蓝，为阴性。 _
