1、ICS 65.020.30 B 43 DB37 山东省地方标准 DB 37/ T 18262011 猪圆环病毒 2 型环介导等温扩增技术 Loop-mediated isothermal amplification for porcine circovirus type 2 2011 - 04 - 08 发布 2011 - 06 - 01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/ T XXXXXXXX I 前 言 本标准的编制依据GB/T 1.1-2009的规定。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研
2、究所；青岛农业大学。 本标准主要起草人：王金宝、李俊、吴家强、韩偲、时建立、周顺、丛晓燕、徐绍建、孙文博、杜 以军。 DB37/ T XXXXXXXX 1 猪圆环病毒 2 型环介导等温扩增技术 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒2型（PCV2）的环介导等温扩增（LAMP）检测技术的要求。 本标准适用于猪血清和组织中猪圆环病毒2型的检测。 2 材料 2.1 器材 2.1.1 微量移液器（最大量程为 10 L、20 L、100 L、1000 L） 2.1.2 20000g 低温离心机 2.1.3 电热恒温水槽 2.1.4 稳流稳压电泳仪 2.1.5 水平电泳槽 2.1.6 凝胶成像系统 2.2 紫外
3、透射反射分析仪试剂 2.2.1 蛋白酶 K 溶液（20mg/mL）：配制见附录 A.1 章 2.2.2 10%十二烷基硫酸钠（SDS 溶液，pH7.2）：配制见附录 A.2 章 2.2.3 Tris 平衡酚 2.2.4 三氯甲烷 2.2.5 无水乙醇 2.2.6 70%乙醇：配制见附录 A.3 章。 2.2.7 5mol/L Betaine 溶液：配制见附录 A.4 章 2.2.8 100mmol/L MgSO4 溶液：配制见附录 A.5 章 2.2.9 Bst DNA Polymerase（8U/ L） 2.2.10 SYBR Green 核酸染料 2.2.11 0.5TBE 缓冲液：配制见
4、附录 A.6 章。 2.2.12 电泳级 1%琼脂糖：配制见附录 A.7 章。 2.2.13 10 mg/mL 的溴化乙锭（EB）水溶液。 2.2.14 DNA Marker 2000 2.3 引物 F3： 5 -CTCCAGTGCTGTTATTCTAGATGA-3 B3： 5 -TTTCCAGCAGTTTGTAGTCTCA-3 FIP：5 -GAAGGGCTGGGTTATGGTATGGC-TTTT-ACAGCCCTCACCTATGACC-3 BIP：5 -CCGCTACTTTACCCCCAAACCT-TTTT-GCCACAGCTGATTTCTTTTGTTG-3 DB37/ T XXXXXXX
5、X 2 3 方法 3.1 病料处理 将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水15 倍稀释，取悬液反复冻融3 次，5000g离心 15min，取上清液-20保存备用。 3.2 病毒 DNA 的提取 3.2.1 取上清液（或血清）500 L 加入 10%SDS 溶液 50 L、20mg/mL 蛋白酶 K 溶液 10 L，于 55水浴 2-3h。 3.2.2 加入 200 L Tris 饱和酚，充分混匀，10000g 离心 15min 3.2.3 取上清液，加入 200 L Tris 饱和酚和 200 L 三氯甲烷，10000g 离心 15min。 3.2.4 取上清液，加入 200 L 三氯甲
6、烷，10000 g 离心 15min。 3.2.5 取上清液，加入 2 倍体积的无水乙醇，-20静置 20min ，10000g 离心 15min。 3.2.6 弃上清液，加入 70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 3.2.7 加入 20 L 灭菌超纯水溶解沉淀，-20保存备用。 3.3 环介导等温扩增（LAMP） 详见表1。 表1 环介导等温扩增反应体系 步骤1 10 ThermoPol 2.5 L 步骤2 dNTP混合液(10mmol/L) 1.5L 步骤3 B3/F3(5 mol/L) 2.0 L2 步骤4 BIP/FIP(50 mol/L) 1.0 L2 步骤5 MgSO 4
7、 (100 mmol/L) 1.0L 步骤6 Betaine(5mol/L) 2.5 L 步骤7 DNA 1.0 L 步骤8 Bst DNA Polymerase(8U/ L) 1 L 步骤8 超纯水 9.5 L LAMP程序设定 每次LAMP均应设一个阴性对照，具体参数见表2。 表2 LAMP 反应程序设定 温度 时间 步骤1 62 60min 步骤2 80 5min 4 结果分析和判定 4.1 电泳操作 4.1.1 1%琼脂糖凝胶板的制备（见附录 A.7） DB37/ T XXXXXXXX 3 称取0.6g琼脂糖，加入60mL 0.5TBE缓冲液中， 加热融化，温度降低后加入1%的EB，倒
8、入电泳槽 中。 4.1.2 加样 将LAMP扩增产物5 L与1 L 6Loading Buffer混合 ，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNA Marker作相 对分子质量指示。每次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物作对照。 4.1.3 电泳 保持稳定电压80V，电泳20min，观察结果。 4.2 结果观察判定 电泳反应结束后，加入1 L SYBR Green 核酸染料，混匀（加深观察颜色），取出凝胶板置凝胶 成像系统仪下观察并拍照。如某一待测样品扩增产物的DNA条带与阳性对照的条带在同一直线上，并与 加样孔的距离相同，则该样品banding为阳性。 在阴性对照成立的情况下，出现瀑布样条带的泳道判
9、为样品阳性（说明样品中含有PCV2），不出现 瀑布样条带的为阴性。 4.3 可视化结果 阳性反应管内液体变为黄色，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色。反应管置于紫外透射反射 分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧光。 4.4 特异性和灵敏度 特异性：扩增 PCV1、 PPV、 PRV等 DNA病毒的 DNA均为阴性。 灵敏度：本技术最低检测的 DNA浓度为 1fg。 DB37/ T XXXXXXXX 4 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶K溶液(20mg/mL) 蛋白酶 K 100mg 灭菌双蒸水 5mL A.2 10%十二烷基硫酸钠(SDS溶
10、液，pH7.2) 十二烷基硫酸钠 10g 灭菌双蒸水 80mL 浓盐酸 调pH至7.2 灭菌双蒸水 加至100mL A.3 70%乙醇 无水乙醇 70mL 灭菌双蒸水 30mL A.4 5mol/L Betaine溶液 Betaine 1.4644g 灭菌双蒸水 2.5mL A.5 100mmol/L MgSO4 溶液 MgSO4.7H2O 0.493g 灭菌双蒸水 20mL A.6 0.5TBE缓冲液 Tris 108g Na2EDTA.2H2O 7.44g 硼酸 55g 灭菌双蒸水 1L，配成10 TBE缓冲液 取10 TBE缓冲液25mL，加灭菌水475mL，制成0.5倍的工作液。 A.7 电泳级 1%琼脂糖 DB37/ T XXXXXXXX 5 琼脂糖 0.6g 0.5TBE缓冲液 60mL _
