1、ICS 65.150 B 50 DB37 山东省地方标准 DB37/T 17792011 水产苗种中硝基呋喃类原药残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 2011-01-06 发布 2011-03-01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 17792011 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省海洋与渔业厅提出。 本标准由山东省海洋渔业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省海洋水产研究所、山东省水产品质量检验中心 。 本标准主要起草人：孙玉增、徐英江、田秀慧、张世娟、李佳蔚、于召强。 DB37/T 17792011 1 水产苗种中硝基呋喃
2、类原药残留量 的测定液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了水产苗种中硝基呋喃类原药残留量测定的液相色谱-串联质谱法。 本标准适用于水产苗种中呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 水产苗种违禁药物抽检技术规范农业部1192号公告-1-2009 3 原理 样品中硝基呋喃类原药残留用甲醇偏磷酸溶液提取，经固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质 谱仪测定
3、，外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。所用试剂除另有指定外，均为分析纯。 4.2 甲醇：色谱纯。 4.3 偏磷酸。 4.4 乙酸铵。 4.5 0.2%偏磷酸溶液：0.2 g 偏磷酸加 100 mL 水溶解，混匀。 4.6 甲醇-偏磷酸溶液（4060）：甲醇（4.1）40 mL 加 0.2 %偏磷酸溶液（4.4）60 mL，混匀。 4.7 5.0 mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵（4.3）0.19 g 用水溶解并定容至 500 mL。 4.8 标准品：呋喃唑酮和呋喃西林纯度均为 99.0%，呋喃妥因纯度为 98.5 %，呋喃它酮纯度为 9
4、4.0 %。 4.9 标准储备液（100 g/ mL）:准确称取呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮各适量，用甲 醇溶解并定容至 100 mL 棕色容量瓶中，配成浓度为 100 g/mL 的标准储备液，18 冰箱中保存， 保存期 6 个月。 4.10 混合标准工作溶液：使用前取标准储备液（4.8），用甲醇稀释成所需浓度。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源。 5.2 涡旋混合器。 5.3 离心机：7000 r/min。 DB37/T 17792011 2 5.4 天平（感量 0.001 g）。 5.5 分析天平（感量 0.00001 g）。 5.6 HLB
5、 固相萃取柱（60 mg，3 mL）。 5.7 均质机。 5.8 超声波清洗仪。 5.9 氮吹仪。 6 试样的测定 6.1 样品的制备 按照水产苗种违禁药物抽检技术规范执行。 6.2 样品的提取 称取匀浆后样品10.0 g 于50 mL 离心管中，加入1 5 mL 甲醇偏磷酸溶液（4.5），涡旋混合30 s， 超声提取 10 min，7 000 r/min 离心10 min，取上清液于至另一离心管中，再用15 mL 甲醇-偏磷酸溶 液提取一次，合并上清液，备用。 6.3 样品的净化 HLB固相萃取小柱依次用5 mL水和5 mL甲醇活化，取备用液全部过柱（流速不超过1 mL/min），用5 mL
6、 10 %甲醇淋洗，用5 mL 甲醇洗脱，35 水浴氮气吹近干。残渣用流动相溶解，定容至1 mL，过0.22 m滤膜，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。 6.4 测定 6.4.1 色谱条件 6.4.1.1 色谱柱：BEH C18，2.1100 mm，1.7 m；或相当者。 6.4.1.2 流动相：A 相：5.0 mmol/L 乙酸铵溶液；B 相：甲醇。 6.4.1.3 流速：0.25 mL/min。 6.4.1.4 进样量：10 L。 6.4.1.5 柱温：35 。 6.4.1.6 流动相梯度洗脱程序见表 1。 表1 流动相梯度洗脱程序 时间，min A 相，% B 相，% 0 95 5 1.0
7、 95 5 3.0 5 95 4.0 5 95 5.0 95 5 6.4.2 质谱条件 条件包括： DB37/T 17792011 3 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描（ESI+）和负离子扫描(ESI-)分段扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM）； d) 电离电压：2.5 kV； e) 离子源温度：110 ； f) 雾化温度：350 ； g) 雾化气流速：700 L/h； h) 各药物母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量和离子化方式见表 2。 表2 硝基呋喃类药物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量和离子化方式 目标化合物 母离子 m/z 子离子 m/z 锥孔电压
8、V 碰撞能量 eV 离子化方式 225.8 121.6 * 28 20 呋喃唑酮 225.8 138.7 28 15 ESI+ 197.0 80.0 15 10 呋喃西林 197.0 124.0 * 15 10 ESI- 236.8 123.0 28 12 呋喃妥因 236.8 151.0 * 28 15 ESI- 325.0 251.9 28 15 呋喃它酮 325.0 281.0 * 28 12 ESI+ 注： * 为定量碎片离子 6.4.3 液相色谱-串联质谱分析 6.4.3.1 定性方法 在同样测试条件下，阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对标准偏差在5%以内，且检测到的 离子的相对
9、丰度，用与最强离子（基峰）的强度百分比表示，应当与浓度相当的校正标准相对丰度一致， 校正标准可以是校正标准品溶液，也可以是添加了标准物质的样品。基峰与次强碎片离子丰度比应符合 表3要求。 表3 基峰与次强碎片离子丰度比要求 相对丰度，% 允许偏差，% 50 20 2050 25 1020 30 10 50 6.4.3.2 定量方法 按6.4.1和6.4.2 设定仪器条件，待仪器稳定后，将混合标准工作液和样品制备液等体积进样测定， 外标法定量。 7 计算 DB37/T 17792011 4 试样中硝基呋喃类原药残留量按公式（1）计算，计算结果需扣除空白值，结果保留三位有效数字。 m V X =
10、. (1) 式中： X 样品中硝基呋喃类原药留量，单位为微克每千克（ g/kg）； 样品溶液中硝基呋喃类原药的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V样品最终定容体积，单位为毫升（mL）； m样品的质量，单位为克（g） 。 8 灵敏度 呋喃唑酮和呋喃它酮的检出限为0.20 g/kg、定量限为0.5 g/kg，呋喃西林和呋喃妥因的检出 限0. 5 g/kg、定量限为1.0 g/kg。 9 准确度 本方法回收率为70 %120 %。 10 精密度 本方法批内相对标准偏差10 %，批间相对标准偏差15 %。 11 方法的线性范围 呋喃唑酮和呋喃它酮的线性范围：1.0 ng/mL100.0 ng/m
11、L，呋喃西林和呋喃妥因的线性范围：2.0 ng/mL100.0 ng/mL。 DB37/T 17792011 5 A A 附 录 A （资料性附录） 色谱图 图A.1 四种硝基呋喃原药混合标准（10.0 ng/mL）质量色谱图 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 0 2009_0516-13 4: MRM of 2 Channels ES+ 225.8 138.7 3.11e5 2.98 2009_0516-13 4: MRM of 2 Channels ES+ 225.8 121.6 3.29e5 3.01
12、 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 2 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 2 2009_0516-13 1: MRM of 2 Channels ES- 197 124 3.33e3 2.88 0.82 4.354.023.07 2009_0516-13 1: MRM of 2 Channels ES- 197 80 3.13e3 2.88 1.33 2.99 3.83 4.894.513.97 5.11 5.76 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 3 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 1 20
13、09_0516-13 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 151.6 1.23e4 2.89 2009_0516-13 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 123.6 2.03e3 2.91 0.07 0.72 1.26 3.81 4.68 4.44 Time 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 0 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 % 0 2009_0516-13 3: MRM of 2 Channels ES+ 325 281 2.96e6 3.00 2009_0516-13 3: MRM of 2 Ch
14、annels ES+ 325 251.9 2.31e6 3.00 DB37/T 17792011 6 图A.2 空白样品质量色谱图 Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 5 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 2 2009_0516-28 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 151.6 317 2.97 1.48 0.35 0.21 1.07 0.92 0.73 0.50 1.33 2.78 2.372.0
15、7 1.66 1.96 2.26 2.60 4.88 4.54 3.79 3.72 3.16 3.38 3.98 4.35 4.13 5.295.14 5.44 5.63 5.92 2009_0516-28 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 123.6 169 3.05 2.71 2.19 1.851.51 1.070.06 0.80 0.69 0.47 0.35 1.25 1.96 2.07 2.49 2.37 2.86 5.44 5.06 3.49 3.38 3.27 4.99 4.13 3.94 3.72 4.39 4.62 5.18 5.55 5.77 Ti
16、me 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 4 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 0 100 2009_0516-28 4: MRM of 2 Channels ES+ 225.8 138.7 1.24e3 5.20 3.10 2.80 2.02 0.56 0.410.34 0.97 0.82 1.911.08 1.57 1.27 1.72 2.62 2.21 2.43 2.92 4.63 3.29 4.52 3.36 4.00 3.89
17、4.41 4.15 5.01 4.75 5.38 5.64 5.83 2009_0516-28 4: MRM of 2 Channels ES+ 225.8 121.6 404 0.11 5.27 2.62 0.26 1.68 0.37 1.160.45 1.01 0.52 0.60 1.35 2.21 2.02 1.76 2.28 3.10 2.80 3.21 3.85 3.44 3.74 3.63 4.07 4.15 4.67 4.52 4.90 5.12 5.76 5.38 5.64 Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.
18、00 5.50 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 3 2009_0516-28 1: MRM of 2 Channels ES- 197 124 350 0.98 0.05 0.35 0.20 0.46 0.76 1.73 1.58 1.50 1.17 1.39 3.90 2.18 1.92 3.34 2.85 2.25 2.59 3.19 3.60 4.27 4.16 4.98 4.68 4.46 5.84 5.69 5.17 5.54 2009_0516-28 1: MRM of 2 Chann
19、els ES- 197 80 171 5.35 5.21 4.53 2.85 0.98 0.83 0.42 0.20 0.50 0.68 2.59 1.13 1.73 1.21 1.43 2.44 2.10 1.95 3.93 3.52 2.96 3.07 3.37 3.75 4.35 4.08 4.64 4.83 5.09 5.95 5.43 5.50 Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 5 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 %
20、2 2009_0516-28 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 151.6 317 2.97 1.48 0.35 0.21 1.07 0.92 0.73 0.50 1.33 2.78 2.372.07 1.66 1.96 2.26 2.60 4.88 4.54 3.79 3.72 3.16 3.38 3.98 4.35 4.13 5.295.14 5.44 5.63 5.92 2009_0516-28 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 123.6 169 3.05 2.71 2.19 1.851.51 1.070.06 0.80 0.69
21、 0.47 0.35 1.25 1.96 2.07 2.49 2.37 2.86 5.44 5.06 3.49 3.38 3.27 4.99 4.13 3.94 3.72 4.39 4.62 5.18 5.55 5.77 DB37/T 17792011 7 图A.3 加标样品（呋喃唑酮和呋喃它酮的添加量为 2.5 g/kg、呋喃西林和呋喃妥因的添加量为 5.0 g/kg）质量色谱图 _ Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 0 100 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.
22、00 4.50 5.00 5.50 % 0 2009_0516-29 3: MRM of 2 Channels ES+ 325 281 7.89e3 2.83 1.30 0.59 3.953.13 5.67 2009_0516-29 3: MRM of 2 Channels ES+ 325 251.9 7.10e3 2.83 1.30 0.25 2.61 2.20 4.814.10 Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.5
23、0 5.00 5.50 % 0 2009_0516-29 4: MRM of 2 Channels ES+ 225.8 138.7 1.38e4 2.99 5.20 2009_0516-29 4: MRM of 2 Channels ES+ 225.8 121.6 1.28e4 2.99 3.18 Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 0 2009_0516-29 1: MRM of 2 Ch
24、annels ES- 197 124 6.73e3 2.85 0.31 2009_0516-29 1: MRM of 2 Channels ES- 197 80 6.44e3 2.89 2.96 Time 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 1 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % 0 2009_0516-29 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 151.6 1.05e4 2.90 4.47 2009_0516-29 2: MRM of 2 Channels ES- 236.8 123.6 2.55e3 2.90 0.77 5.51 5.144.774.43
