1、ICS 65.020 B 01 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 33752018 小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒检测 技术规程 Detection and identification of wheat yellow mosaic virus and Chinese wheat mosaic virus 2018 - 07 - 19发布 2018 - 08 - 19实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 33752018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：
2、山东省农业科学院植物保护研究所。 本标准主要起草人：吴斌、辛相启、姜珊珊、张眉、王升吉、辛志梅。 DB37/T 33752018 1 小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的间接ELISA 、 Dot-ELISA和普通 RT-PCR检测方法。 本标准适用于冬小麦叶片组织中小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试
3、验方法 GB/T 14926.50 实验动物 酶联免疫吸附试验 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 SN/T 2964 植物病毒检测规范 SN/T 1666 水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法 普通RT -PCR方法和实 时荧光 RT-PCR方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 小麦黄花叶病毒 wheat yellow mosaic virus（WYMV） 马铃薯 Y病毒科（ Potyviridae），大麦黄花叶病毒属（ Bympvirus） ， 病毒粒子、传播途径及危害： 病毒粒体线状，病毒基因组由两条单链正义 RNA组成，在自然界中由禾谷多
4、黏菌（ Polymyxa graminis L.） 在土壤中传播。侵染小麦后，在心叶上出现黄绿相间的斑驳或不规则条纹，整个植株株形松散、矮小， 穗短小，甚至出现畸形穗，籽粒不饱满，导致产量和品质下降。 3.2 中国小麦花叶病毒 Chinese wheat mosaic virus（CWMV） 真菌传杆状病毒属（ Furovirus） ，病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒体杆状，病毒基因组由两 条单链正义 RNA组成，在自然界中由禾谷多黏菌（ Polymyxa graminis L.）在土壤中传播。侵染冬小麦， 造成叶片褪绿、黄化 、分蘖增生、植株矮缩，严重时死亡。 3.3 酶联免疫吸附测定 en
5、zyme linked immunosorbent assay，ELISA 具体描述参照GB/T 14926.50。 DB37/T 33752018 2 3.4 间接酶联免疫吸附测定 indirect enzyme linked immunosorbent assay，IELISA 简称： IELISA，首先用样品中抗原包被于固相载体，经洗涤，加入相应病毒的抗体，形成待测抗原 -抗体复合物，再经孵育洗涤后，加入酶标记二抗，形成固相抗原 -抗体 -酶标二抗复合物，测定加底物 后的显色程度， 确定待测抗体含量。 3.5 斑点酶联免疫吸附测定 dot enzyme linked immunosorb
6、ent assay，Dot -ELISA 以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中常用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。不仅 保留了常规ELISA 的优点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特异 性强，被检样品用量少，节省材料，不需特殊仪器，结果判定简单易行和便于长期保存等特点。 Dot-ELISA 的基本原理与常规ELISA 基本相同，即将抗原或抗体首先吸附在纤维素薄膜（如硝酸纤维素 膜）表面， 并保持其免疫活性，通过与相应的抗体或抗原和酶标记物的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合 物，在底物的参与下，结合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉
7、着于抗原抗体复合 物吸附的部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点。试验的结果通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。 3.6 逆转录-聚合酶链式反应 reverse transcription polymerase chain reaction，RT -PCR 简称RT -PCR。具体描述参照 SN/T1666。 4 方法原理 小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依 据。两种病毒都具有很强的免疫原性，同时都是RNA病毒，因此可利用间接ELISA 、Dot -ELISA和 RT-PCR 方法确定样品中是否带有上述两种病毒。 5 主要仪器设备、用具和试剂 5
8、.1 仪器和设备 ： a) 酶标仪 ； b) 洗板机 ； c) 电子天平（感量 0.001 g）； d) PCR 仪 ； e) 电泳仪 ； f) 水平电泳槽 ； g) 凝胶成像仪 ； h) 高速冷冻离心机 ； i) 水浴锅 ； j) 样品冷藏柜（2 8 ）； k) 低温冰箱（ -20 ） ； l) 超低温冰箱（-80 ）； DB37/T 33752018 3 m) 磁力搅拌器 ； n) 高压灭菌锅 ； o) 可调微量移液器（10 L 、100 L 、200 L 、1000 L ）。 5.2 用具： a) 无 RNase 吸头（10 L、 100 L 、200 L、1000 L） ； b) 96
9、 孔酶标板 ； c) 硝酸纤维素膜（ NC 膜） ； d) 无 RNase 离心管； e) PCR 反应管； f) 研钵； g) 样品袋 ； h) 标签； i) 镊子。 5.3 主要试剂： a) WYMV 抗体、 CWMV 抗体、 WYMV 特异性引物、 CWMV 特异性引物、 Trizol、液氮、三氯甲烷、异丙 醇、乙醇、 M-MLV RT 反转录酶、RNA 酶抑制剂、 Taq DNA 聚合酶、DNA 分子标记、 Gelred、琼 脂糖等。除特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂； b) 血清学和分子生物学检测试剂配制见附录 A。 6 样品采集与保存 2月下旬至3 月下旬，冬小麦返青
10、期，观察田间有无出现连片黄色，新叶表现黄绿相间的与叶脉平行 的不规则条纹，下部叶片坏死枯黄，植株矮小、分蘖减少等症状。对有相应症状的叶片进行采集，每份 采集5 g 10 g。样品采集后，在冷藏条件下（ 2 8 ）运送至实验室。如果样品在 2 d内检测，可 暂时储存于 2 8 ；如果样品在 2 d以后检测，保存至 -80 超低温冰箱备用，样品避免反复冻融。 7 检测 7.1 间接酶联免疫吸附测定 7.1.1 样品制备 待测样品按1： 10（质量：体积）加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆， 4 冰箱放置 4 h5 h， 8000 r/min离心3 min ，上清液即为制备好的检测样品。设阴性对照和阳性
11、对照，阴性对照样品为未感染病毒 的健康小麦植株叶片，阳性样品为分别感染WYMV和 CWMV的小麦植株叶片，阴性样品及阳性样品皆通过 RT-PCR检测及测序验证。阴性对照、阳性对照作相同的处理。样品提取缓冲液作空白对照。 7.1.2 加样 在96孔酶标板上加入制备好的待检测样品、阴性对照、阳性对照、空白对照，每个样品平行加到两 个孔中，每孔加样100 L，加盖 ，4 冰箱孵育过夜。 7.1.3 洗板 孵育结束后，用 PBST清洗酶标板 3次 5次。每孔每次加 PBST洗液 700 L，每次停留1 min2 min。 DB37/T 33752018 4 7.1.4 加抗血清 用抗体稀释缓冲液按照相
12、应病毒抗血清的使用浓度进行稀释，每孔加入稀释好的抗体液100 L， 加盖， 37 孵育 1.5 h。 7.1.5 洗板 同7.1.3。 7.1.6 加酶标抗体 用抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中， 100 L/ 孔，加盖， 37 孵育1.5 h 。 7.1.7 洗板 同7.1.3。 7.1.8 加底物缓冲液 将现配的底物缓冲液按100 L/ 孔，加入到酶联板 中，室温避光孵育 1 h。 7.1.9 读数 每孔加 100 L 3 M NaOH终止剂终止反应，用酶标仪在 405 nm波长下测定各孔的吸光值（ OD405）。 7.2 斑点酶联免疫吸附测定 7.2.1 N
13、C膜制备 剪裁7 cm 7 cm大小的 NC膜，用铅笔在保护纸外划成7 mm 7 mm大小的方格，划好后去掉保护纸备 用。 7.2.2 样品制备 待测样品按 1： 10（质量：体积）加入 PBS磷酸盐缓冲液，用研钵研磨成浆， 8000 rpm/min离心 3 min， 上清液即为制备好的检测样品。设阴性对照和阳性对照，阴性对照样品为未感染病毒的健康小麦植株叶 片，阳性样 品为分别感染 WYMV和CWMV 的小麦植株叶片，阴性样品及阳性样品皆通过 RT-PCR检测及测序验 证。阴性对照、阳性对照作相应的处理。样品提取缓冲液作空白对照。 7.2.3 加样 分别取2 L 制备好的待检测样品、阴性对照
14、、阳性对照、空白对照，点到NC 膜的相应格子中，室 温干燥 10 min。每个样品平行在膜上重复一次。 7.2.4 封闭 在平皿（9 cm）中加入 20 mL封闭液，并将干燥好的 NC膜浸入，室温下封闭 30 min。 7.2.5 加抗血清 用封闭液按照相应病毒抗血清的工作浓度进行稀释，并将 NC膜浸入，室温孵育 30 min 60 min。 7.2.6 洗膜 DB37/T 33752018 5 将平皿中抗体液倒出，加入PBST 20 mL洗膜 3 次 4 次，每次3 min 。 7.2.7 加酶标抗体 用抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并将NC 膜浸入，室温孵育30 min60
15、 min。 7.2.8 洗膜 同7.2.6。 7.2.9 显色 显色底物NBT 66 L和 BCIP 33 L 加到 10 mL底物缓冲液中混匀，洗好的膜用滤纸吸干后放入底物 显色液中反应，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时终止反应（显色5 min 20 min ），即在 蒸馏水中漂洗，肉眼观察并记录结果。 7.3 逆转录-聚合酶链式反应检测 7.3.1 总RNA提取 称取0.1 g 植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的无RNase 1.5 mL 离心管中，加人 1 mL 的Trizol试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置5 min；4 ，12000 g 离心10 min ，取上清液；
16、加入200 L 三氯甲烷，上下颠倒混匀，室温静止15 min ；4 ，12000 g离心 10 min，取上层水相移入新的离心管 中；加等体积的异丙醇（约600 L ），轻柔颠倒混匀，室温放置 15 min；4 ，12000 g离心 10 min， 小心弃上清液；加1 mL预冷的 75 %的乙醇洗涤沉淀，4 ，7500 g离心 5 min，弃乙醇；沉淀于室温下 干燥5 min 10 min，溶于30 L 无 RNase的ddH 2O，轻弹管壁使之溶解， -80 保存备用。设阴性对照， 阴性对照样品为未感染病毒的健康小麦植株叶片，感染WYMV和 CWMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作 空白对照
17、。阴性对照、阳性对照作相应的处理。 7.3.2 引物合成 引物合成按照表 1。 表1 引物合成 检测病毒 引物名称及序列 扩增片段大小 小麦黄花叶病毒 WYMV-F: 5 -CAGAAGGAGGAAGCTCGACT-3 375bp WYMV-R: 5 -CGTGCTTGTTTCGCAACTTC-3 中国小麦花叶病毒 CWMV-F: 5 -GGCCGTGAAATCTGGTTATAC-3 740bp CWMV-R: 5 -TCTGTTTCTATCTGGCCAGC-3 7.3.3 逆转录 逆转录总体积为 20 L。在 无 RNase的PCR 管中依次加入 3 L待检测 RNA， 1 L相应病毒下游扩
18、增引 物（ 20 M）， 8 L无 RNase的 ddH2O，在 65 温浴5 min。迅速置于冰上 5 min。再向 PCR管中加入下 列试剂： M-MLV RT（ 200 U/L） 1 L 、 RNasin（40 U/ L） 1 L 、 5RT缓冲液 4 L 、 dNTP（10 mmol/L） 2 L ，混匀，PCR 仪中 42 反应 1 h，70 反应 5 min。同样处理阳性对照、阴性对照和空白对照，合 成的cDNA与 -20 冰箱中保存备用。 7.3.4 PCR扩增 DB37/T 33752018 6 依次在灭菌的PCR 管中加入： ddH2O 14.8 L、 10PCR缓冲液 2.
19、5 L 、MgCl 2（ 25 mmol/L）2.5 L、dNTP（10 mmol/L ）2 L、10 pmol/ L上游引物 1 L、10 pmol/ L下游引物 1 L、Taq 酶（ 5 U/ L） 0.2 L、 cDNA模板 1 L，混匀。按如下程序进行 PCR扩增： 95 5 min，然后 95 30 s ， 56 30 s， 72 1 min ，35 个循环；最后 72 10 min 。4 保存 PCR产物。 7.3.5 琼脂糖凝胶电泳检测 制备1 % 的琼脂糖凝胶。取上述PCR 产物 10 L ，加入1 L上样缓冲液，混匀后移入胶孔，并在样 品孔一侧加入DNA 分子量标记， 120
20、 V电压下电泳 30 min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观 察是否扩增出预期的特异性条带，并于阳性对照比较，拍摄并记录。 8 结果判定及表述 8.1 结果判定 8.1.1 间接酶联免疫吸附测定 8.1.1.1 对照孔的 OD405 值( 缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即： a) 缓冲液孔和阴性对照孔的 OD405 值0.15 ，当阴性对照孔的 OD405 值 2；孔的重复性基本一致， 否则判定本批次检测无效，需重新检测。 8.1.1.2 在满足了质量控制要求后，结果原则上可判断如下： a) 样品 OD405 值/ 阴性对照 OD405 值2 ，判为阳性；
21、b) 样品 OD405 值/ 阴性对照 OD405 值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做一次，或用其他方法 验证； c) 样品 OD405 值/ 阴性对照 OD4052，判为阴性； d) 重复孔结果不一致时，视此次结果无效，需进行重新验证。 8.1.2 斑点酶联免疫吸附测定 8.1.2.1 肉眼观察，阳性对照应出现棕红色或深褐色圆形斑点，阴性对照应无显色斑点。 8.1.2.2 对照成立的情况下，肉眼观察各个被检测样品，凡出现棕红色或深褐色圆形斑点者判为阳性， 与阴性对照相同不出现可见斑点者判为阴性，介于两者之间判为可疑，需重新做一次，或用其他方法验 证。 8.1.2.3 重复孔结果不一致时，视
22、此次结果无效，需进行重新验证。 8.1.3 逆转录-聚合酶链式反应 8.1.3.1 根据阳性对照、阴性对照和空白对照的电泳图表现判断检测是否有效，如无效时，则需重新 检测。 8.1.3.2 如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的所测病毒的扩增条带，判定 结果为阳性。阳性对照、阴性对照和空白对照正确，且样品无扩增条带，判定结果为阴性。 8.2 结果表述 检出结果表述如下： a) 检出小麦黄花叶病毒或未检出小麦黄花叶病毒； b) 检出中国小麦花叶病毒或未检出中国小麦花叶病毒。 DB37/T 33752018 7 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 间接酶联免疫吸
23、附测定 A.1.1 包被缓冲液（pH 9.6） 碳酸钠（Na 2CO3） 1.59 g，碳酸氢钠（ NaHCO3） 2.93 g，溶解于 900 mL蒸馏水中，用盐酸调节 pH至 9.6，用蒸馏水定容至 1000 mL。 A.1.2 PBST缓冲液（pH 7.4） 氯化钠（NaCl ） 8.0 g，磷酸二氢钾（ KH2PO4） 0.2 g，磷酸氢二钠（ Na2HPO4） 1.15 g，氯化钾（ KCl） 0.2 g，0.5 mL Tween-20 ，溶解于900 mL 蒸馏水中，用盐酸调节pH 至7.4 ，蒸馏水定容至1000 mL 。 A.1.3 抗体缓冲液 PVP（MW 24 4000）（
24、聚乙烯吡络烷酮） 2 g，脱脂奶粉 1 g，溶解于 100mL PBST中。 A.1.4 底物稀释缓冲液（pH 9.8） 二乙醇胺9.7 mL，氯化镁（ MgCl2） 0.01 g，溶解于80 mL蒸馏水中，用盐酸调节 pH至9.8 ，用蒸馏 水定容至100 mL 。 A.1.5 底物溶液（现配先用） 1 mg PNPP（对- 硝基苯磷酸二钠）溶于1 mL底物缓冲液中。 A.1.6 抗血清 病毒特异性抗体。 A.1.7 酶标抗体 碱性磷酸酶标记抗体。 A.2 斑点酶联免疫吸附测定 A.2.1 PBS磷酸盐缓冲液（pH 7.2） 氯化钠（NaCl ） 8.0 g，磷酸二氢钾（ KH2PO4） 0
25、.2 g，磷酸氢二钠（ Na2HPO4） 1.15 g，氯化 钾（ KCl） 0.2 g，溶解于900 mL 蒸馏水中，用盐酸调节 pH至7.2，蒸馏水定容至 1000 mL。 A.2.2 PBST缓冲液（pH 7.4） 氯化钠（NaCl ） 8.0 g，磷酸二氢钾（ KH2PO4） 0.2 g，磷酸氢二钠（ Na2HPO4） 1.15 g，氯化钾（ KCl） 0.2 g，0.5 mL Tween-20 ，溶解于900 mL 蒸馏水中，用盐酸调节pH 至7.4 ，蒸馏水定容至1000 mL 。 DB37/T 33752018 8 A.2.3 封闭液 取脱脂奶粉 5 g加入到 100 mL PB
26、ST，充分溶解， 4 保存。 A.2.4 底物稀释缓冲液（pH 9.5） TrisCl 12.11 g，氯化镁（MgCl 2） 2.38 g，氯化钠（NaCl ）5.85 g，溶解于 900 mL蒸馏水中， 用氢氧化钠调节 pH至 9.5，用蒸馏水定容至 1000 mL。 A.2.5 底物溶液（现配先用） NBT和BCIP 。 A.2.6 抗血清 病毒特异性抗体。 A.2.7 酶标抗体 碱性磷酸酶标记抗体。 A.3 逆转录-聚合酶链式反应 A.3.1 50TAE TrisCl 242 g，冰乙酸 52.1 mL，Na 2EDTA2H2O 37.2 g，溶解于 900 mL蒸馏水中，蒸馏水定容至 1000 mL。使用时加水稀释至 1TAE。 A.3.2 上样缓冲液 0.05 %溴酚蓝， 0.9 % SDS，50 % 甘油水溶液。 _
