1、ICS 65.020.30 B45 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3317 2018 鸡白血病多重 PCR和斑点杂交检测方法 Laboratory detection technologies of multi-PCR and dot hybridation for diagnosis of Avian leukosis (AL) 2018 - 06 - 12发布 2018 - 07 - 12实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3317 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化
2、技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：成子强。 DB37/T 3317 2018 1 鸡白血病多重 PCR和斑点杂交检测方法 1 范围 本标 准规定了我省针对禽白血病的诊断检测技术的方法。 本标准适用于企、事业单位禽病诊断实验 ALV-A/B和 ALV-J的检测 ,判断鸡群是否患 A/B、 J亚群白血 病。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 26436 禽白血病诊断技术 NY/T 680 禽白血病病毒 p
3、27抗原酶联免疫吸附试验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 禽白血病 Avian Leukosis， AL 反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为 主的可传染的肿瘤性疾病，临床症状主要表现为嗜睡、食欲不振、鸡体消瘦、鸡冠和肉髯呈淡紫色，腹 部显著增大，胸骨异常隆起。根据病毒囊膜蛋白的抗原性差异、病毒干扰实验、宿主范围等生物学特性， 将禽白血病肉瘤病毒群分成 A-J共 10个亚群，其中 A、 B、 C、 D、 E和 J亚群的宿主是鸡，流行于我国禽群 的主要是 A、 B和 J亚群。 ALV-J的危害最为严重，目前在鸡群中平均感染率为
4、 10 %左右，呈现间歇性爆发； ALV-A/B零星爆发，平均感染 率在 1 %左右。 J亚群主要诱发髓细胞性白血病，而 A/B亚群主要造成淋巴细 胞性白血病和肉瘤。禽白血病自发现以来，发病率不断呈上升趋势，在世界各地均有发生，呈世界性分 布，是危害养禽业的主要疾病之一。 3.2 多重 PCR技术 Multiple polymerase chain reaction， M-PCR 在普通 PCR的基础上加以改进 ,于一个 PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个 DNA模板或同一 模板的不同区域扩增多个目的片段的 PCR技术。 3.3 斑点分子杂交技术 dot blotting 是直接从待
5、检鸡只的组织或 血液样品提取 DNA, 将变性的 DNA样品点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上， 然后与制备的特异性探针进行杂交来检测样品中的前病毒 DNA。 DB37/T 3317 2018 2 4 试剂或材料 除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。 4.1 常规使用的商品化的 DNA 提取试剂盒。 4.2 常规使用的商品化的 RNA 提取试剂盒。 4.3 LB 培养基所需胰蛋白胨（ Rryptone）、酵母抽提物（ Yeast Extract）试剂。 4.4 Multi Hotstart DNA Polymerase(5 U/ L)、 10 Multi Hotstart Buffer(+Mg2+
6、)、 Mgcl2（ 25 Mm）、 Super Pure dNTP(2.5 Mm each)、 PCR 琼脂糖凝胶回收试剂盒、 RNA prep Pure 培养细胞 /细菌总 RNA 提取试剂盒。 4.5 DL 1000 DNA Marker、 PMD 18-T 载体、 6 loading Buffer、 PrimeScriptTMRT Master Mix。 4.6 禽白血病抗原检测试剂盒。 4.7 斑点杂交所需溶液。 4.7.1 1 M 马来酸：见附录 A 中 A.1。 4.7.2 洗涤缓冲液 (马来酸缓冲液 )：见附录 A 中 A.2。 4.7.3 显色缓冲液：见附录 A 中 A.3。
7、4.7.4 l M Tris-盐酸溶液：见附录 A 中 A.4。 4.7.5 10 % SDS（ sodium dodecyl sulfate）溶液：见附录 A 中 A.5。 4.7.6 20 SSC（ saline sodium citrate）溶液：见附录 A 中 A.6。 4.7.7 封闭溶液（ Blocking 溶液）：见附录 A 中 A.7。 4.7.8 抗体溶液：见附录 A 中 A.8。 4.7.9 预杂交溶液：见附录 A 中 A.9。 4.7.10 杂交溶液：见附录 A 中 A.10。 4.7.11 NBT/BCIP 显色液：见附录 A 中 A.11。 4.7.12 探针标记和检
8、测试剂盒（使用 Roche 公司产品）。 4.7.13 制备探针所需特异性引物序列：见附录 B。 4.7.14 PT-PCR 扩增条件见附录 C。 5 仪器设备 5.1 各量程移液枪， PCR 仪，梯度 PCR 仪，紫外分光光度计。 5.2 高速台式冷冻离心机。 5.3 紫外分析仪。 5.4 凝胶成像系统。 5.5 MK3 型酶标仪。 5.6 恒温摇床。 5.7 恒温恒湿箱、立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台。 5.8 双稳定时电泳仪、核酸电泳槽。 5.9 超声波细胞粉碎机。 5.10 数显超纯水机。 5.11 全自动雪花制冰机 5.12 数显恒温水浴锅。 5.13 电热恒温鼓风干燥箱。 5.14
9、 Heal Force 二氧化碳培养箱。 DB37/T 3317 2018 3 5.15 pH 计。 5.16 恒温磁力搅拌器。 5.17 三洋超低温保存箱。 5.18 高压灭菌器。 5.19 硝酸纤维素膜或尼龙膜。 5.20 冰箱。 6 样品采集 6.1 组织样品 该病主侵器官是肝、脾、肾，采集组织样品时，主要采集肝脏、脾脏、肾 脏，同时应采取有明显病 变与健康交界处的组织。用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品装入冻存管，编号，迅速放入液氮罐中或送 实验室 -80 冰箱备用。 6.2 样品储运 样品采集后，将采集的样品放入编号的冻存管中，迅速投入液氮罐中或置于冰盒中，密封，送实验 室冻存备用。 6
10、.3 样品存放 样本采集后迅速放入液氮罐中，若需长期保存应放在 -80 冰箱，但应避免反复冻融。 7 操作方法 7.1 方法概要 7.1.1 多重 PCR 基于 ALV-A、 ALV-J的保守性基因，合成了特异性引物（见附录 D），从混合病毒中，提取了混合病 毒的 RNA并逆转录为 cDNA，运用多重 RT-PCR技术扩增出 545 bp(ALV-J)、 692 bp(ALV-A)的特异性片段。 7.1.1.1 ALV-A、 ALV-J的扩增 将复苏后的 DF-1细胞进行传代 25 cm2的培养瓶， 4 h后取保存于 -80 的病毒液，经 0.22 m滤器 过滤除菌，接种 1.5 mL于细胞，
11、 1 h后弃病毒液，加入 5 mL的 PBS清洗后，再加入 1 %的 DMEM培养基维持 7 d， 7 d后收集细胞上清即为扩增的病毒液。 7.1.1.2 接毒培养细胞总 RNA的提取 培养 7 d后的细胞吸弃上清后，按照 1 mL每瓶（以覆盖细胞瓶底壁为参考） 25 %胰酶进行消化 30 s， 倒弃胰酶后加入 PBS 5 mL清洗细胞，移入离心管后按照 1006.2 g离心 2 min。将分离的细胞用商品化试 剂盒提取 RNA，并反转录成 cDNA，保存于 -80 超低温冰箱中。 7.1.1.3 总 RNA的逆转录反应 先去除 RNA中的 DNA： 5gDNA Eraser Buffer 2
12、L， gDNA Eraser 1L，总 RNA 1g, 加无 RNAse双蒸 水至 10L， 42 2 min； 然后进行 RNA的逆转录：在以上的液体中加 5 PrimeScriptTMRT Master Mix 2L,加无 RNAse双蒸水 至 20L，混匀后， 37 反应 15min， 85 5S，然后置于 4 。 7.1.1.4 多重 RT-PCT 体系 见附录 E。 7.1.1.5 PCR 反应后以 1.5 %琼脂糖凝胶电泳进行分析 DB37/T 3317 2018 4 7.1.2 斑点杂交 准备好自制的特异性探针，提取样品 DNA，将变性的 DNA样品点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，
13、然后 与制备的特异性探针进行杂交，通过观察出现的斑点来检测样品中的前病毒 DNA。 7.1.2.1 样品 DNA 的制备 按照 DNA提取试剂盒说明书的方法，提取 DNA，并于 4 保存备用。 7.1.2.2 探针目的基因设计与合成 用 DNAStar 软件设计通用探针和各亚群探针的目的基因，送生物技术 有限公司合成 ALV p27部分基 因和 ALV-J env部分基因作为探针目的基因。 7.1.2.3 核酸探针标记 a) 按照地高辛标记试剂盒的说明书对上述回收的通用探针基因片断和各亚群探针基因片段进行 标记。在 Eppenderf 管中，加 1 gDNA 模板，高压灭菌双蒸水至 16 L；
14、 b) 沸腾水浴变性 10 min，迅速冰浴 2 min, 充分变性有利于标记； c) 将混合地高辛引物 4 L，至变性的 DNA 中，离心 313 g； d) 孵化 37 ， 24 h，时间延长会增加标记产物； e) 加 2 L 0.2 M EDTA(pH=0.8)终止反应。 7.1.2.4 探针标记效率的检测 a) 分别从 2 9 管（标记探针）和标记阴性探针对照中取 1 L 到尼龙膜； b) 固定核酸到膜上（烤箱 120， 30 min）； c) 把尼龙膜转移到 20 mL 马来酸缓冲液里面，摇晃 2 min； d) 10 mL 封闭液孵育 30 min； e) 10 mL 一抗孵育 3
15、0 min； f) 10 mL 洗涤液冲洗 15 min 2 次； g) 10 mL 稀释液平衡 2 min 5 min，调节 pH=9.5； h) 2 mL 底物显色液黑暗中孵育； i) 50 mL 灭菌双蒸水冲洗尼龙膜，终止反应。 7.1.2.5 斑点杂交检测 a) 剪 取适合大小的尼龙膜 0.7 mm 0.7 mm，划好格子，做好标记； b) 膜上做好标记，分别吸取 1.0 L 样品 DNA 点于膜上格子中央； c) 将硝酸纤维素膜（ NC 膜，点样面朝上）放于已用变性液饱和的双层滤纸上变性 10 min； d) 再放于已用中和液饱和的双层滤纸上中和 5 min； e) NC 膜室温干燥
16、 30 min，然后在 80 干烤 2 h 固定 DNA； f) 将 NC 膜放于预杂交液于 68反应 2 h，期间经常摇动 NC 膜； g) 将探针于沸水中变性 10 min，取出立即置于冰水浴中 5 min；将变性的探针倒入预杂交液中， 充分混匀即成杂交液，使 NC 膜在其中 68 杂交 6 h 以上（一般杂交过夜）；将膜取出放于 直径 11 cm 平皿中，杂交液回收可反复使用； h) 将 NC 膜放于洗液中于室温洗涤 15 min， 2 次，期间经常摇动 NC 膜；洗液中于 68洗涤 15 min， 2 次，期间经常摇动 NC 膜；缓冲液中洗 1 min；缓冲液中反应 30 min，期间
17、经 常摇动 NC 膜； i) 在 20 ml 缓冲液中加入 4 L 抗 Digoxiaenin 抗体（碱性磷酸酶标记物，用之前离心 5 min， 7826 g，将膜放于其中 37 浸泡 30 min；洗膜：缓冲液洗涤； 5 min 5 次； j) 缓冲液中反应浸泡 2 min；在适当大小的平皿中加入 10 mL 缓冲液和 100 L（ NBT 和 BCIP 混合物），将 NC 膜放入其中显色 30 min 1 h，注意显色时应避光保存；加入 TE 缓冲液（ pH 8.0）终止显色反应。 DB37/T 3317 2018 5 7.2 结果判定 7.2.1 多重 PCR结果分析条件设定 7.2.1
18、.1 以 ALV-A、 ALV-J 为阳性对照，凝胶电泳上阳性对照出现特异性目的条带为检测结果成立的前 提条件，否则结果不成立。 7.2.1.2 凝胶电泳上未出现特异性目的条带判定为阴性。 7.2.1.3 凝胶电泳上出现特异性目的条带判定为阳性。 7.2.2 斑点杂交结果 7.2.2.1 以标准模式株 ALV 为阳性对 照， SPF 鸡肝脏、禽网状内皮组织增生症病毒（ REV）、马立克氏 病病毒（ MDV）为阴性对照，阳性对照出现斑点和阴性对照不出现斑点为检测结果成立的前提条件，否 则结果不成立。 7.2.2.2 点样膜上不出现斑点视为阴性。 7.2.2.3 尼龙膜上加样点处 ALV-env 探针出现清晰的斑点为阳性结果。 8 技术评价 8.1 多重 PCR 技术具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点 ,适合大量样本的分析与鉴定。 8.2 斑点杂交检测技术的优点是杂交时一张膜上可同时检测多个样品，操作方便，耗时相对较短，并 可做半定量分析；该方法无需特殊的仪器设备，试剂成本较低，阳性信号清晰 。 8.3 两种技术结合可鉴别 ALV-A 和 ALV-B 的感染，同时可排除内源性禽白血病病毒的干扰，提高 ALV-A/B 和 ALV-J 诊断的准确率。 _
