1、ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3319 2018 水貂、狐和貉犬瘟热病毒等 10种病毒性病 原实时荧光 PCR检测方法 Real-time fluorescent PCR for detecting of distemper virus and other 10 viral pathogens of mink, fox and raccoon dog 2018 - 06 - 12发布 2018 - 07 - 12实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3319 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则
2、起草。 本标准的附录为资料性附录。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东 省动物疫病预防与控制中心、山东大学生命科学学院、威海市动物疫病 预防控制中心。 本标准主要起草人：王贵升、王金宝、田夫林、张鹤晓、崔凯、张月、张华杰。 DB37/T 3319 2018 1 水貂、狐和貉犬瘟热病毒等 10种病毒性病原实时荧光 PCR检测方法 1 范围 本标准规定了水貂、狐和貉犬瘟热病毒等 10种病毒性病原实时荧光 PCR检测方法。 本标准所规定的实验室检测方法适用于水貂、狐和貉的犬瘟热病毒、细小病毒、冠状病毒、轮状病 毒、星状病毒、阿留申病毒
3、、杯状病毒、博卡病毒、圆环病毒、伪狂犬病毒等 10种病毒的荧光 PCR检测 方法，其他动物参考。 2 规范性引用文 件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 3 缩略语 荧光 PCR 实时荧光聚合酶链式反应 Ct值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数 DNA 脱氧核糖核酸 RNA 核糖核酸 Taq酶 Taq
4、DNA 聚合酶 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 4 试剂和材料 4.1 荧光定量 PCR 检测仪及配套反应管（板）。 4.2 高速台式冷冻离心机（离心速度 12000 r/min 以上）。 4.3 混匀器。 4.4 恒温水浴锅。 4.5 冰箱（ 2 8 和 -20 两种）。 4.6 微量移液器（ 0.5 L 10 L， 5 L 20 L， 20 L 200 L， 200 L 1 000 L）及配套吸头。 4.7 1.5 mL 离心管（无核酸酶）。 4.8 DNARNA 核酸提取试剂等。 5 样品的采 集与前处理 DB37/T 3319 2018 2 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程
5、中须戴一次性手套。 5.1 取样工具 5.1.1 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、 Eppendorf 管。 5.1.2 所有上述取样工具必须经（ 121 2 ）， 15 min 高压灭菌并烘干或经 160 干烤 2 h。 5.2 采样方法 5.2.1 拭子样品 a) 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头及上腭来回刮 3 次 5 次，取咽喉分泌液。然后将 拭子插入到装有 1.0 mL PBS 无菌 Eppendorf 管中，编号备用。 b) 肛拭子采样，采样时要将拭子深入肛门回刮 3 次 5 次，取排泄物。然后将拭子插入到装有 1.0 mL PBS 无菌 Eppendorf 管中，编号备用。 5.2
6、.2 内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 1.0 g于研钵中充分研磨，再加 5.0 mL PBS混匀，然后将组织悬 液转入无菌 Eppendorf管中，编号备用。 5.2.3 血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌 Eppendorf管中，编号备用。 5.3 存放与运送 采集或处理的样本在 2 8 条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，须放置 -70 以下冰箱， 但应避免反复冻融（最多冻融 3 次）。采集的样品密封后，采用保温设施加冰密封，尽快运送到实验室。 6 引物及探针 引物及探 针见表 1“荧光 PCR方法的引物及探针”。 表 1 荧光 PCR方法的引物及探针 RNA
7、病毒 犬瘟热病毒 F GCAAGCGAGGATTGAGGGTAT R GGCCTATGGGACACACTCAAA Probe FAM-CACCGACCATCCAGACGTTGCTCCT-BHQ 星状病毒 F TCCAGGCATTTGAGTATGCC R CCACATAATCCTGGGGGA Probe FAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ 冠状病毒 F TGGGAC(T)TATCCT(A)AAG(A) TGTGA R TAA(G)CACACAACNCCATCATC Probe FAM-CGGGAGTCGTGGGAC-BHQ 杯状病毒 F CTGACTTCAAATTTCATCTC R
8、TGGGAATTAAGTCAGAGG Probe FAM-ATCTATGCTCACTCATGGATCTGTC-BHQ 轮状病毒 F TTTATAGATAATGTATGTATGGATG R CCAATTCTCAATGTAATCAG Probe FAM-AATAGCCAGAGAATCAGAACGAA- BHQ 细小病毒 F CGTCTACACAAGGGCCATTTA R CCATGTTGTCTACCAAATGCAT DB37/T 3319 2018 3 表 1 荧光 PCR方法的引物及探针 （续） 细小病毒 Probe FAM-CGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCA-BHQ DNA
9、病毒 博卡病毒 F AGACGA CGCCTAGTTGTTTGGT R CAGTCCCTCCCAAGATACA CTTTG Probe FAM- AGGTTCCAC CCAATCCTGGTGCATTAAGC- BHQ 伪狂犬病毒 F GCCAACCCGCTCGTGCTC R CACGAACACGCAGTCGCAGTA Probe FAM-GGCAGGTGCTGGGACTCGGGC- BHQ 圆环病毒 F CTCCCAATCTCCCTATTTGAT R ATCTGTTCCTTTCGCTTTCTC Probe FAM-ACACCCCACCTACAGGGGTTCGC -BHQ 阿留申病毒 F ACC
10、CTCCAGGTCAACTCTT R TTAGTAAATACACCAGGTTCTCC Probe FAM-TGAGTTCTCTTTTAACAGGATTCC-BHQ 7 操作方法 7.1 样本核酸 DNA病毒的提取 在样本处理区进行。 7.1.1 在 1.5 ml 的 eppendorf 管中加入样品上清液 200 ul，加入 1 ml 的 DNA 提取细胞裂解液， 25 L 蛋白酶 K 混匀， 56 水浴 2 h，期间不时轻微摇匀。加入 10 L RNA 酶， 37 酶解 1 h。 7.1.2 加入 200 ul 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象）， 室
11、温放置 10 min。 7.1.3 离心 4 、 12000 r/min、 15 min，取上层液相移入另一管（切 忌吸动白色中间相）。 7.1.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置 10 min。 7.1.5 离心 4 、 12000 r/min、 15 min，用移液器小心吸去所有上清。 7.1.6 加 1 ml 75 %乙醇洗一遍，离心 4 、 8000 r/min、 10 min，用移液器小心吸去所有上清，重 复洗涤一次 ,在超净台中干燥 5 min。 7.1.7 加入 40 l 60 lTE 溶解 DNA， -20 保存备用。 注 1： 可采用经验证的病毒 DN
12、A/RNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取 DNA/RNA。 7.2 样本核酸 RNA病毒的提取 所提取物为血清、血液、 细胞培养液、鸡胚尿囊液和动物组织等中的病毒。提取时尽量在人少时进 行，防止空气中 RNA 酶的污染。所用一切物品也应是无 RNA 酶的。 7.2.1 在 1.5 ml 的 eppendorf 管中加入样品上清液 200ul，再加入 TRIzol 1 ml，充分混匀，室温放 置 10 min。 7.2.2 加入 200 ul 的氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象）， 室温放置 10 min。 7.2.3 离心 4 、 13000 r/
13、min、 15 min，取上层液相移入另一管（切忌吸动白色中间相）。 7.2.4 加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体 ，室温放置 10 min。 7.2.5 离心 4 、 13000 r/min、 15 min，用枪小心吸去所有上清。 DB37/T 3319 2018 4 7.2.6 加 1 ml75 %乙醇洗一遍，离心 4 、 8000 r/min、 10 min，用枪小心吸去所有上清，重复此 步骤 ,在超净台中干燥 5 min。 7.2.7 加入 40 l 60 lTE 溶解 RNA， -20 保存备用。 注 2： 可采用经验证的病毒 DNA/RNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用说
14、明书提取 DNA/RNA。 7.3 扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行，不区分 DNA病毒和 RNA病毒。 7.3.1 室温温浴 PCR 反应液， 2000 r/min 离心 5 sec； 7.3.2 准备 n 个洁净经无核酸酶的 PCR 反应管，设所需 PCR 管数为 n（ n = 样本数 + 1 管阴性对照 + 1 管阳性对照）； 7.3.3 每个测试反应体系需要 15 L PCR 反应液和 0.3 L Taq 酶。计算好各试剂的使用量，加入一 适当体积离心管中，充分混合均匀，向每个 PCR 管中各分装 15 L，转移至样本处理区。 7.4 加样 在样品处理区进行，分别向上述 PCR管中
15、加入样本核酸提取步骤 7.1中制备的 DNA（或 RNA）溶液各 10 L，使总体积达 25 L。盖紧管盖后， 1000 r/min离心 30 sec。 7.5 荧光 PCR反应 -在检测区进行 将加样后的 PCR管放入荧光 PCR检测仪内，记录 PCR管摆放顺序。反应参数设置： 7.5.1 DNA病毒： a) 第一阶段，预变性 50 保持 2 min； 95 保持 3 min； b) 第二阶段， 95 15 sec， 60 60 sec，共 40 个循环，最后 40 10 sec；荧光收集在第二 阶段每次循环的延伸时进行。 7.5.2 RNA病毒： a) 第一阶段，反转录 45 /15 mi
16、n； 95 /3 min； b) 第二阶段， 95 15 sec， 60 60 sec，共 40 个循环，最后 40 10 sec；荧光收集在第 二阶段每次循环的 延伸时进行。 8 结果判定 8.1 结果分析条件的设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点为准。 对于多通道荧光 PCR仪，选定 FAM(465-510)检测通道读取检测结果， ABI仪器选择 FAM无荧光淬灭基团。 8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照选用 TE 溶液做模板。阴性对照无 Ct/Cp 值并且无扩增曲线。 8.2.2 阳性对照选用每种病毒引物基因阳性克隆质粒提取核酸做模
17、板。阳性对照的 Ct/Cp 值应小于等 于 28，并出现典型的扩增曲线。 8.2.3 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 8.3 结果判定 8.3.1 阴性： 无 Ct/Cp 值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。 8.3.2 阳性： Ct/Cp 值 30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品为阳性。 8.3.3 Ct/Cp 值大于 30.0，且出现典型的扩增曲线的样品建议复验。复验仍出现上述结果的，判为阳 性，否则判为阴性。 9 废弃物处理 DB37/T 3319 2018 5 实验检测过程中产生的废弃物严格按照实验室生物安全管理的要求进行处理并做好记录。 DB37/T 33
18、19 2018 6 A A 附 录 A （规范性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水配方 所用试剂均为分析纯以上。 A.1 0.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 溶液：称取 6.055 g Tris置于 100 mL烧杯中 ，加入 80 mL水，用 浓 HCl调节 pH值至 8.0，定容至 100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.2 0.5 mol/L EDTA（ pH 8.0）溶液：称取 18.61 g Na2EDTA2H2O置于 100 mL烧杯中，加入 80 mL水， 用 10 %的 NaOH 溶液，调节 pH值至 8.0，定容至 100 mL，高压灭菌后室温保存待用。 A.
19、3 10 % SDS：称取 10 g SDS溶解于 80 mL灭菌水中，定容至 100 mL。储存于灭菌过的容器中待用。 A.4 5 mol/L NaCl溶液：称取 29.25 g NaCl溶解于 80 mL水中，定容至 100 mL，高压灭菌后室温保存 待用。 A.5 细胞裂解液： 取 0.5 M Tris-HCl（ PH8.0） 40 mL， 0.5 M EDTA （ pH8.0） 5 mL， 5.0 M NaCl 10mL， 10 % SDS 5 mL，定容至 100 mL。 A.6 20 mg/mL蛋白酶 K溶液：准确称量 0.2 g蛋白酶冻干品，加水溶解，定容至 10 mL，分装后于
20、 -20 保存。 A.7 RNA酶溶液：将 1 g冻干品 RNA酶 A溶于 6 mL 无菌水中，于 100 加热 15 min，缓慢冷却至室温， 定容至 10 mL，分装成小份存于 -20 。 A.8 75 %乙醇：量取 75 mL无水乙醇，加入 25 mL水。 A.9 TE缓冲液：将 0.5 mL的 10 mmol Tris-HCl (pH8.0)、 0.1 mL的 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 加入到 容量瓶中，调 pH8.0，加 0.1 %DEPC水定容至 50 mL，高压灭菌后，降至室温， 4 保存备用。 A.10 0.1 %DEPC水： 100 ml dd水中加入 DEPC0.1 ml，充分振荡， 37 孵育 12 h以上， 121 高压灭 菌 20 min，于 4 保存。 _
