1、ICS 67.120 B45 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3234 2018 动物源食品中泰万菌素残留量的测定 液相色谱 串联质谱法 Determination of tylvalosin residue in animal source food by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry 2018 - 05 - 17 发布 2018 - 06 - 17 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3234 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则
2、起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：青岛农业大学。 本标准主要起 草人：郝智慧、魏秀丽、曲少奇、唐启和、翟冰、孙京新、徐坤、袁玉清、黄亭亭。 DB37/T 3234 2018 1 动物源食品中泰万菌素残留量的测定 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本标准规定了动物源食品中泰万菌素药物残留量的液相色谱 串联质谱法测定法。 本标准适用于猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝等动物源食品中泰万菌素药物残留量的测定。 本标准检测限为 0.4 g/kg，定量限为 1.0 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用
3、文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单 ）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 采用乙腈提取试样中残留的泰万菌素，提取液采用氮气吹干重新溶解后，经混合型阴离子固相萃取 小柱净化，浓缩，用液相色谱 串联质谱检测，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水符合 GB/T 6682一级水的规定。 4.1 乙腈（ CH3CN）：色谱纯。 4.2 甲醇（ CH3OH）：色谱纯。 4.3 甲酸（ HCOOH）：色谱纯。 4.4 氨水（ NH3H2O）。 4.5 异丙醇（ C3H8O）。 4.6
4、2 %甲酸水溶液：准确取甲酸（ 4.3） 2.0 mL，加水稀释并定容至 100 mL。 4.7 10 %氨化甲醇异丙醇溶液： 10 %氨化甲醇 +异丙醇 =1+1，准确取浓氨水（ 4.4） 10 mL，加甲醇（ 4.2） 90 mL稀释至 100 mL，再加入 100 mL异丙醇（ 4.5）混匀即得。 4.8 0.1 %甲酸乙腈溶液： 0.1 %甲酸 +乙腈 =7+3，准确量取 0.1%甲酸水溶液（ 4.9） 70 mL，加甲醇（ 4.2） 30 mL，用水稀释至 100 mL。 4.9 0.1 %甲酸水溶液：准确移取甲酸（ 4.3） 0.5 mL，加水稀释并定容至 500 mL，过 0.2
5、2 m水系微 孔滤膜脱气备用。现用现配 。 4.10 标准品：酒石酸乙 酰异戊酰泰乐菌素（ Acetylisovaleryltylosin Tartrate）， CAS编号： 63428-13-7。泰万菌素（ Tylvalosin）又称为乙酰异戊酰泰乐菌素。 4.11 泰万菌素标准储备液：准确称取酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素标准品约 11.5 mg（精确到 0.01 mg） （ 4.10），加乙腈（ 4.1）至 100 mL，配制成 100.0 g/mL的溶液，作为外标储备液， -20 冰箱保存。 DB37/T 3234 2018 2 4.12 泰万菌素标准工作液：准确量取一定体积的泰万菌素标准储
6、备液（ 4.11），用乙腈稀释成浓度为 1 g/mL的标准工作液 。现配现用。 4.13 混合型阴离子固相萃取小柱： 150 mg/6 mL,， 30 m。 4.14 聚丙烯离心管： 50 mL， 15 ml具塞，带刻度。 4.15 微孔滤膜： 0.22 m有机相过滤膜。 5 仪器设备 5.1 液相色谱 串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）。 5.2 天平：感量 0.01 g。 5.3 分析天平：感量 0.00001 g。 5.4 均质器（ 20000 r/min）。 5.5 氮气吹干仪。 5.6 真空泵及固相萃取装置。 5.7 色谱柱： C18（ 4.6 mm 150 mm, 5 m，或
7、相当者）。 5.8 高速冷冻离心机（ 10000 r/min）。 5.9 涡旋振荡器。 6 测定步骤 6.1 试 料的制备 试料的制备包括： a) 取均质后的供试样品，作为供试试样； b) 取均质后的空白样品，作为空白试样； c) 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试样。 6.2 试料的保存 -18 以下保存。 6.3 提取 a) 称取试样 2 g（精确至 0.01 g），置于 50 mL 聚丙烯离心管中，加入 10 mL 乙腈 (4.1)，均质 提取 1 min后， 5000 r/min 离心 5 min，取上清液至另一干净的 50 mL离心管中； b) 残渣中加入 1
8、0 mL 乙腈重复提取一下，离心后合并上清液； c) 将提取液置于 50 水浴中，吹氮浓缩至干； d) 在残渣中 加入 1 mL甲醇 (4.2)，涡旋振荡 30 s，待净化。 6.4 净化 a) 取混合型阴离子固相萃取小柱 (4.3)，依次使用 3 mL甲醇、 3 mL水活化，保持柱体湿润； b) 将待净化溶液转移至已活化好的混合型阴离子固相萃取小柱上； c) 依次用 3 mL 2 %甲酸水溶液 (4.6)、 3 mL甲醇清洗，用真空泵抽干小柱 10 s； d) 用 10 %氨化甲醇异丙醇溶液 6 ml (4.7)洗脱入 15 mL离心管，将提取液置于 50 水浴中； DB37/T 3234
9、2018 3 e) 吹氮浓缩至干，加入 1 mL 0.1 %甲酸乙腈溶液（ 4.8），涡旋振荡 30 s，过有机微孔滤膜后， 液相色谱 串联质谱仪测定。 6.5 标准曲线的制备 准确量取适量的泰万菌素标准工作液，用 0.1 %甲酸乙腈溶液（ 4.8）稀释成浓度分别为 0.5 g/L、 1 g/L、 2 g/L、 5 g/L、 10 g/L的对照溶液，供液相色谱 串联质谱仪分析。 6.6 测定 6.6.1 液相色谱参考条件 6.6.1.1 色谱柱： C18色谱柱， 4.6 mm 150 mm, 5 m, 或相当者。 6.6.1.2 流动相 A： 0.1 %甲酸水溶液；流动相 B：乙腈；流速： 0
10、.3 mL/min。 6.6.1.3 进样量： 5 L。 6.6.1.4 柱温： 35 。 6.6.1.5 流动相及梯度洗脱条件见表 1。 表 1 流动相及梯度洗脱条件 时间 （ min） 0.1%甲酸水溶液（ %） 乙腈（ %） 0.0 70 30 0.5 70 30 4.0 30 70 4.5 70 30 7.0 70 30 6.6.2 质谱参考条件 6.6.2.1 电离模式：电喷雾正离子（ ESI+） a) 毛细管电压： 3 v；离子源温度： 110 ； b) 脱溶剂温度： 320 ； c) 脱溶剂氮气流速： 550 L/h； d) 监测方式：多反应监测（ MRM）。 6.6.2.2 泰
11、万菌素的特征离子对、碰撞能量和锥孔电压见表 2。 表 2 泰万菌素的特征离子对、碰撞能量和锥孔电压 序号 化合物 母离子 子离子 锥孔电压 /V 碰撞能量 /eV 1 泰万 菌素 1042.5 109.6 30 45 6.6.3 定性测定 6.6.3.1 通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标准 溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。 6.6.3.2 试样与对照品保留时间的相对偏差在 2.5 %之内；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准 溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 3的规定，则可判断试样中存在泰万菌素残留。 表 3 定性测定时相对离子丰度的最大
12、允许偏差 相对离子丰度 ,% 50 20 至 50 10 至 20 10 允许的相对偏差 ,% 20 25 30 50 DB37/T 3234 2018 4 6.6.4 定量测 定 6.6.4.1 对基质标准工作溶液进样，以峰面积为纵坐标、基质标准工作溶液浓度为横坐标绘制标准工 作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中泰万菌素的响应值应在仪器测定的线性范围内。 6.6.4.2 泰万菌素标准溶液的多反应监测（ MRM）色谱图参见附录 A中的图 A.1。 7 结果计算 供试试样中泰万菌素残留量 X，单位为 ng/g，按式 (1)计算： mA VCAX 21 . (1) 式中： A1试样溶液
13、中泰万菌素峰面积； A2标准溶液中泰万菌素峰面积； C标准溶 液中泰万菌素浓度，单位为纳克每毫升 (ng/mL)； V溶解残渣的初始流动相体积，单位为毫升 (mL)； m试样质量，单位为克 (g)。 注 1： 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 8 检测方法的灵敏度、准确度和精密度 8.1 灵敏度 本方法泰万菌素检出限为 0.4 g/kg，定量限为 1 g/kg。 8.2 准确度 本方法泰万菌素在 0.5 g/kg、 1 g/kg、 10 g/kg添加水平的回收率为 90 % 110 %。 8.3 精密度 本方法批内相对标准偏差 8 %，批间相对标准偏差 8 % 。 DB37/T 3234 2018 5 A A 附 录 A （资料性附录） 泰万菌素标准溶液的 MRM 色谱图 图 A.1 泰万菌素标准溶液（ 10 g/L）的多反映监测 (MRM)色谱图 _
