1、ICS 11.220 B41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3232 2018 中兽药散剂中 4 种喹诺酮类药物的测定 液相色谱 -串联质谱法 Determination of four quinolones in chinese veterinary medicine powder by liquid chromatography tandem mass spectrometry 2018 - 05 - 17 发布 2018 - 06 - 17 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3232 2018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则
2、起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：青岛农业大学、中国农业大学。 本标准主 要起草人：郝智慧、魏秀丽、邱梅、唐启和、翟冰、孙京新、徐坤、袁玉清、张瑞丽、黄 亭亭、王苹苹。 DB37/T 3232 2018 1 中兽药散剂中 4 种喹诺酮类药物的测定 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本标准规定了中兽药散剂中喹诺酮类药物含量测定的液相色谱 -串联质谱法（ LC-MS/MS）。 本标准适用于止痢散、四黄止痢颗粒、白头翁散、苍术香连散、扶正解毒散和黄连解毒散中盐酸洛 美沙星、甲磺酸培氟沙星、盐酸左氧氟沙星、烟酸诺氟沙星含量的测定。 本标
3、准检测限为 0.06 g/kg，定量限为 0.2 g/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必 不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 原理 用甲酸乙腈溶液提取中草药散剂中的喹诺酮类药物，蒸干、复溶、过滤，用液相色谱 -串联质谱法 测定，外标法定量。 4 试剂或材料 除非另有规定，所有试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682中一级水的规定。 4.1 甲酸：高效液相色谱纯。 4.2 乙腈：色谱纯。 4.3 0.2 %甲酸水溶液：移
4、取甲酸（ 4.1） 2 mL，加水定容至 1000 mL，混匀。 4.4 0.2 %甲酸乙腈溶液：移取 0.2 mL 甲酸（ 4.1），以乙腈（ 4.2）定容至 100 mL，混匀。 4.5 0.2 %甲酸 -乙腈溶液：量取 10 mL 0.2%甲酸水溶液（ 4.3）于 90 mL 乙腈（ 4.2）中，混匀。 4.6 盐酸洛美沙星对照品。 4.7 甲磺酸培氟沙星对照品。 4.8 盐酸左氧氟沙星对照品。 4.9 烟酸诺氟沙星对照品。 4.10 标准储备液（ 100.0 mg/L）：分别精密称取盐酸洛美沙星（ 4.6）、甲磺酸达氟沙星（ 4.7）、 盐酸左氧氟沙星（ 4.8）、烟酸诺氟沙星对照品（
5、 4.9）各约 1.0 mg（精确到 0.01 mg），用乙腈溶解并 稀释 成浓度为 100.0 mg/L 的标准储备液。 2 8 ，有效期为 3 个月。 4.11 混合标准液（ 1.0 mg/L）：分别准确量取 4 种喹诺酮类药物单个标准储备液（ 4.10）各 1 mL 置 于 100 mL 容量瓶中，用乙腈稀释定容至 100 mL。现配现用 。 4.12 有机微孔滤膜： 0.22 m。 DB37/T 3232 2018 2 5 仪器设备 5.1 分析天平：感量 0.00001 g 5.2 天平：感量 0.01 g。 5.3 振荡器。 5.4 离心机： 4000 r/min。 5.5 旋转蒸
6、发仪。 5.6 液相色谱 -质谱联用仪（ LC-MS/MS）：配有电喷雾离子源（ ESI+）。 6 试验步骤 6.1 样品前处理 6.1.1 称取试样 5 g（精 确到 0.01 g )于 50 mL 离心管中，加入 0.2 %甲酸乙腈溶液（ 4.4） 10 mL， 充分振荡提取 10 min， 4 000 r/min 离心 5 min，转移上清液至 50 mL 的梨形瓶中。 6.1.2 残余物按上述方法重新提取 1 次，合并 2 次上清液，混匀。 6.1.3 上清液经 50 旋转蒸发至近干，准确加入 1 mL 0.2 %甲酸 -乙腈溶液（ 4.5）溶解残渣，振荡 混匀，过 0.22 m 有机
7、微孔滤膜（ 4.12），待测。 6.2 标准曲线的制备 6.2.1 准确量取 1.0 mg/L 混合标准储备液（ 4.11），用 0.2 %甲酸 -乙腈溶液（ 4.5）进行系列 稀释， 配制成浓度分别为 1.0 ng/mL、 5.0 ng/mL、 10.0 ng/mL、 25.0 ng/mL、 50.0 ng/mL、 100.0 ng/mL 的混 合标准工作液，过 0.22 m 有机微孔滤膜（ 4.12），测定。 6.2.2 以混合标准工作液浓度为横坐标，特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。 6.3 测定 6.3.1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱： C18柱， 100 mm 2.1
8、 mm（粒径 1.7 m 或相当者）； b) 流动相： A 相为 0.2 %甲酸溶液（ 4.3）， B 相为乙腈（ 4.2），梯度洗脱，条件见表 1； c) 柱温： 35 ； d) 流速： 0.4 mL/min； e) 进样量： 10 L。 表 1 梯度洗脱程序 序号 时间（ min） A（ %） B（ %） 1 0.0 90 10 2 4.0 80 20 3 5.0 20 80 4 6.0 80 20 5 7.0 80 20 6 8.0 90 10 DB37/T 3232 2018 3 6.3.2 质谱参考条件 6.3.2.1 离子源：电喷雾离子源（ ESI+）。 6.3.2.2 温度： 1
9、00 。 6.3.2.3 监测方式：多反应监测（ MRM 模式）。 6.3.2.4 毛细管电压： 3.0 kV。 6.3.2.5 萃取锥孔电压： 5 V。 6.3.2.6 射频透镜电压： 0.5 V。 6.3.2.7 脱溶剂温度： 350 。 6.3.2.8 脱溶剂气流：氮气， 600 L/h。 6.3.2.9 锥 孔气流：氮气， 50 L/h。 6.3.2.10 各化合物的特征离子及其相对应的碰撞能量、锥孔电压见表 2。 表 2 喹诺酮类化合物测定的特征离子对、碰撞能量和锥孔电压 药物名称 母离子 子离子 碰撞能量 /eV 锥孔电压 /V 盐酸 洛美沙星 352.1 265.3* 20 32
10、 308.2 15 甲磺酸 培氟沙星 334.2 316.2* 30 35 290.3 20 盐酸左 氧氟沙星 362.3 318.2* 25 35 261.2 20 烟酸 诺氟沙星 320.3 302.3* 25 40 276.3 18 注 1： *为定量离子对。 6.3.3 定性测定 高于检测限时，待测物质选择 1个母离子和 2个子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留 时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在 2.5 %之内，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接 近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表 3规定的范围，则可判定为样品中 存在对应的待测物质。 表
11、3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度， % 50 20 50 10 20 10 允许的最大偏差， % 20 25 30 50 6.3.4 定量测定 6.3.4.1 高于定量限时 ，取基质匹配标准溶液进样，得到色谱峰面积响应值，用单点校准，外标法进 行定量。 6.3.4.2 试样溶液中待测物质的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 6.3.4.3 上述色谱和质谱条件下，基质匹配标准溶液特征离子色谱图参见附录 A 中图 A.1 至图 A.6。 DB37/T 3232 2018 4 7 试验数据处理 试样中目标化合物含量 X，单位为微克每毫升（ g/kg），按式 (1)计算： mA
12、VCAX 21 . (1) 式中： A1试样溶液中对应目标化合物的峰面积； A2混合标准工作液中对应目标化合物的峰面积； C混合标准工作液中对应目标化合物的浓度，单位为纳克每毫升 (ng/mL)； V试样溶液蒸干残渣定容体积，单位为毫升 (mL)； m试样质量，单位为克（ g）。 8 检测方法准确度和精密度 8.1 准确度 本方法盐酸洛美沙星、甲磺酸培氟沙星、盐酸左氧氟沙星、烟酸诺氟沙星在 0.4 g/kg、 4 g/kg、 20 g/kg添加水平的回收率为 80 % 110 %。 8.2 精密度 本方法批内相对标准偏差 15 %，批间相对标准偏差 15 %。 DB37/T 3232 2018
13、 5 A A 附 录 A （资料性附录） 基质匹配喹诺酮类化合物标准溶液特征离子色谱图 基质匹配喹诺酮类化 合物标准溶液特征离子色谱图见图 A.1至图 A.6。 注 1： 1-盐酸左氧氟沙星； 2-盐酸洛美沙星； 3-甲磺酸培氟沙星； 4-烟酸诺氟沙星。以下同此。 图 A.1 止痢散基质匹配喹诺酮类化合物标准溶液（ 20 ng/mL）特征离子色谱图 DB37/T 3232 2018 6 图 A.2 四黄止痢散基质匹配喹诺酮类化合物标准溶液（ 20 ng/mL）特征离子色谱 图 A.3 白头翁散基质匹配喹诺酮类化合物标准溶液（ 20 ng/mL）特征离子色谱图 DB37/T 3232 2018 7 图 A.4 苍术香连散基质匹配喹诺酮类化合物标准溶液（ 20 ng/mL）特征离子色谱图 图 A.5 扶正解毒散基质匹配喹诺酮类化合物标准溶液（ 20 ng/mL）特征离子色谱图 DB37/T 3232 2018 8 图 A.6 黄连解毒散基质匹配喹诺酮类化合物标准溶液（ 20 ng/mL）特征离子色谱图 _
