1、ICS 67.060 B21 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 31042018 向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准 The variety purity identification technique of sunflower seeds with SSR 2018 - 02 - 02发布 2018 - 03 - 02实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 31042018 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业厅提出。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位 :山东农业大学、北京德农种业有限公司。 本标
2、准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。 本标准为首次发布。 I DB37/T 31042018 向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准 1 范围 本规程规定了SSR 分子检测向日葵种子纯度的试剂配比、 DNA提取、 SSR引物选择、多重PCR 方法、 PCR 产物检测等技术要求。 本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 3543 种子检验技术规程 GB 20464 农作物种子标签通则
3、 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 杂交种 各种直接用于生产的杂交向日葵 一代种子。 3.2 品种纯度 品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。 3.3 标准样品 能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。 3.4 引物 一条互补结合在模板 DNA链上的短单链，能提供3 -OH末端作为DNA 合成的起始点，延伸合成模板DNA 的互补链。 4 原理 1 DB37/T 31042018 从向日葵种子中提取 DNA，利 用 SSR引物进行 PCR扩增，不同碱基长度的 PCR扩增引物通过聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离，
4、并通过染色显示DNA 指纹谱带类型。不同向日葵品种由于遗传组成不同，基因组中 DNA 简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR 扩增、电泳、染色程序获得的 DNA指纹图谱加以区 分，从而对不同品种进行鉴定。杂交种纯度鉴定时，可从附表中选取亲本有差异的SSR 引物。品种纯度 鉴定时，从附表中选择生产上常用品种间有差异的引物。 5 仪器与试剂 5.1 仪器 电子天平，水平摇床，双垂直板电泳槽 ， PCR仪， 电泳仪 ，高压灭菌锅，观片灯。 5.2 试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、谷氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺（ TEMED）、 氢氧化钠、氢氧化钾、甲醛、2 Pow
5、er Taq PCR Master Mix、 超纯 水、SSR 引物、 硝酸银 （所用试剂 均为分析纯，所用水均为去离子水) 。 6 溶液 6.1 提取液 称取0.56 g 氢氧化钾于 100 mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100 mL， 4 贮存备用。 6.2 30% 凝胶溶液 称取292 g丙烯酰胺 于1000 mL烧杯中，加去离子水溶解，再加入8 g甲叉双丙烯酰胺 ，溶解后定容 至1000 mL ，4 贮存备用。 6.3 5TBE 称取54 gTris、 3.72 g乙二胺四乙酸二钠、 27.5 g硼酸于 1000 mL烧杯中，溶解后定容至 1000mL。 6.4 催化剂 称取10
6、g过硫酸胺于 100 mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至 100 mL，4 贮存备用。 6.5 电极缓冲液 取5 TBE 200 mL，用去离子水定容至1000 mL 。 6.6 染色液 称取1 g硝酸银溶于500 mL去离子水中。 6.7 显色液 称取10 g 氢氧化钠 溶于 500 mL去离子水中，用时加 2 mL甲醛 。 7 操作程序 2 DB37/T 31042018 7.1 DNA提取 从送验样品中随机数取向日葵 种子 200 粒， 将种子剥壳后纵切，放入 1.5 mL离心管中，加入 300 L 提取液，提取时间1 min 24 h均可 ， 使用前 混匀 、静止 5 分钟、离心 30
7、00 rpm，0.5 min ，取上清 即为 DNA样品，用于 PCR扩增时DNA 样品模板量为 2 L 。 7.2 扩增体系 采用20 L 扩增体系，其中每对U- primers的上下游引物 (10 M )各0.5 L ， 2 L 25mmol/L MgCl2 ， 0.2 L 5U/L Taq 酶，2 L10 PCR Buffer，2 L DNA提取液，用灭菌后的 超纯水 补足 20 L 。 7.3 多重PCR扩增程序 通用多重PCR 扩增程序采用“ 两段循环模式” ： a) 预变性 (94 ， 5 min)； b) 第一段循环 (循环数： 3)命名为 “逐一退火循环 ”：变性 (94 ，
8、40 s)；按 照未加通用接头前 的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一退火，每个退火温度的退火时间为 20 s；延伸 (72 ，30 s) ； c) 第二段循环 (循环数： 28 32，通常为 30 个循环 )：变性 (94 ， 40 s)；将退火和延伸过程合 并(70 ， 50 s)； d) 终延伸 (72 ， 10 min)。 引物选择参考附表，每个杂交种选择 3 5 对亲本有差异的引物扩增。 7.4 扩增产物检测 可用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，也可用高通量检测设备，对PCR 产物进行检测。聚丙烯酰胺凝胶电 泳检测程序如下。 7.4.1 凝胶制备 将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶 的方式
9、组装玻璃板，用铁夹固定，取 20 mL 5TBE，30 mL 30 %Acr，50 mL去离子水于烧杯中，加 800 uL1000 uL的10 % APS，80 uL 100 uL TEMED 混匀，灌 入板中，插入梳子， 10 min左右聚合 ，拔出梳子， 吸取多余的水 ，装板。 7.4.2 点样 用微量移液器取 2 ul体系加入样品槽，每加一个样品后，清洗移液器两次，区分不同引物加marker 。 7.4.3 电泳 加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板， 将电源线正极接下槽，负极接上槽。接通电源， 180 V稳压电泳 2.5 h。 7.4.4
10、 卸板、染色、显色 倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，将胶放入去离子水中水平摇床1 min ，倒掉去离子 水，加入染色液硝酸银， 水平摇床2 min 3 min，倒掉，加入去离子 ，水水平摇床1 min ，倒掉，加入 显色液500 ml（2 % 氢氧化钠，用时加入甲醛2 ml），水平摇床至显色为止，倒掉显色液，加入去离子 水水平摇床 1 min。 7.4.5 谱带分析 3 DB37/T 31042018 待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性 。对检测的 SSR引物双亲谱带同时 出现的为本品种，只有某一亲本谱带为亲 本，谱带与双亲位置有差异的籽粒为杂粒。 8 结果计算
11、 计数供检样品粒数（ N）和非本品种粒数（M），并按式计算电泳测定值 X%（保留一位小数）。 X（%） =（N - M ）/ N100 9 结果报告 按照GB/T 3543，写明对照样品名称，使用的亲本有差异的引物数量，检测粒数，纯度%。对送样样 品的检验需注明：“结果仅对样品负责”；监督检验时，需注明：“结果对种子批负责”。 4 DB37/T 31042018 A A 附 录 A （规范性附录） 引物及其参数 表A.1 规定了标准中引物及其参数。 表A.1 引物及其参数 引物名称 序列(5to3) Tm 退火温度 ORS928-F CATGGTTATTTTGGTTTGGGTTT 54.8 5
12、4 ORS928-R GCTATTATCATGTCCTTGTCCTTTT 57.1 ORS613-F GTAAACCCTAGGTCAATTTGCAG 58.4 55(+2、 +1) ORS613-R ATCTCCGGAAAACATTCTCG 55.8 ORS543-F CCAAGTTTCAGTTACAATCCATGA 56.8 56 ORS543-R GGTCATTAGGAGTTTGGGATCA 58.2 ORS694-F CCTGGAACTGAACCGAGAAC 59.8 59(-1、 +1、 +2) ORS694-R GCCGTGAAACAGAGAGAGGA 59.8 ORS956-F G
13、GACCAGATTGCTTCCTAGACTT 60.2 54 ORS956-R TCAACATGCGTGATTATTGTTTG 54.8 ORS483-F CCGAACAACAATCTCCACAA 55.8 55 ORS483-R GGTTTAGGTGTCGCATCACA 57.8 ORS925-F ATGATTCTAAGTTGCGGTAGTGC 58.4 57 ORS925-R GTTGGGTTTAAGTTGTTGCTTCC 58.4 ORS1025-F GACATGGCTTGAACATTTGATTA 54.8 54 ORS1025-R TCTTATATGCACATCAGTACAAGTCTC
14、 59.0 ORS1021-F AACCCTAATCCAACCAGATACGA 58.4 57 ORS1021-R TACCACCAGCTCATCCTTAACCT 60.2 ORS1079-F TACGACTGACGATTCCATTTCTC 58.4 57 ORS1079-R AACTGGATTTCACAGGGAGTGTT 58.4 ORS1256-F GATGTTGATGTTGGTGAAGTTGC 58.4 57 ORS1256-R CTCCGTCACCTTAAGCACTTGTA 60.2 ORS409-F TCCCAGACTAGAGATCGACCA 60.0 57 ORS409-R AAA
15、CTCAAGGGACTAAGGTTGC 58.2 ORS1108-F ACCACACTTATCCAAAGGTTTAAGG 58.7 58（- 1） ORS1108-R CGTGAGAGTAGTTACGAGAAGGAGA 62.0 5 DB37/T 31042018 表A.1 引物及其参数 (续) 引物名称 序列(5to3) Tm 退火温度 ORS727-F GGTGGCAAGTGGTGGTTAGA 59.8 57 ORS727-R AAAGCTGGTCATCTCAAGGGTA 58.2 ORS801-F CCATCTTGGACGCACATCTA 57.8 57 ORS801-R GAACCAC
16、CCGATCATATCCA 57.8 ORS366-F AACCAACTGAGCATTCTTGTGA 56.3 55 ORS366-R GCGCTAGGTTAAAGAGGACAAA 58.2 ORS331-F TGAAGAAGGGTTGTTGATTACAAG 56.8 55 ORS331-R GCATTGGGTTCACCATTTCT 55.8 ORS1065-F ACCGCTGTCAACACCTTAAACTC 60.2 59（- 1） ORS1065-R GGCTGGGAATCAACTGCTACTAC 62.0 ORS885-F AATGTAAGCCAGAATCCCAAATG 56.6 56
17、ORS885-R CCTTCGTCGTTTCCAAGTAGATT 58.4 ORS1088-F ACTATCGAACCTCCCTCCAAAC 60.1 56 ORS1088-R GGATTTCTTTCATCTTTGTGGTG 56.6 ORS1141-F CGCATATGGGAACGTATACACAC 60.2 56(-1) ORS1141-R TGAAACTGAACACAAGGCATACA 56.6 ORS565-F TGGTCAACGGATTTAGAGTCAA 56.3 55 ORS565-R TCCAGTTTGGTCTTGATTTGG 56.1 ORS621-F CGCCTTATGCTG
18、AGAGGAAA 57.8 57 ORS621-R CCTGAAGCGAAGAAGAATCG 57.8 ORS785-F CAAAATACCCAGGTCAAAGCA 56.1 55(+2) ORS785-R CCTAGCTTATGGGACGTATGGA 60.1 ORS1242-F GCAATCGTTTCACTCTTCCATTC 58.4 57 ORS1242-R TGGTCGTAGAATTGTCGGTCAT 58.2 ORS1036-F CCCTTTCACTTCCTATTTTCTATTCA 57.3 56（+2 、+1 ） ORS1036-R CTAAGAGGGGTCGGTATGATTTC
19、60.2 ORS512-F CACTCTTGATTAATCACAGTATCTTGC 59.0 57 ORS512-R GCAGGGACCAATGTTGTCATA 58.0 ORS78-F GTTCGTCGAGTACATGTTCTGC 60.1 55 ORS78-R TTTCCCTCTGGAAAGTTGTCA 56.1 ORS844-F ACGATGCAAAGAATATACTGCAC 56.6 55 ORS844-R CATGTTTAATAGGTTTTAATTCTAGGG 55.9 ORS695-F TCACCTCATTCTTCACTTTCCA 56.3 55 ORS695-R TTGGTGGT
20、GGCAGCTATGTA 57.8 ORS537-F TTCTCCCCAAAAACATTCCA 53.7 53 ORS537-R AAAGAGGAGGCTTGATGATGA 56.1 6 DB37/T 31042018 表A.1 引物及其参数 (续) 引物名称 序列(5to3) Tm 退火温度 ORS70-F GACCCTGGTCACCGAAGTTA 59.8 54（- 1） ORS70-R ATCTGAAATCGGACAAGATTCA 54.5 ORS505-F GTGCGTTGGCTCTTATGGAT 57.8 53 ORS505-R AGTGATGGCATTCCCAATTT 53.7 O
21、RS456-F CCAAGGAATTCTAACAAGAGTTTAAG 57.3 56 ORS456-R GATTTCTCACTTCACTCCTCTATGC 60.3 ORS966-F TCAAAGATGTCACCATAGGAAAGA 56.8 56 ORS966-R ATTTGCTGAGACCATGAGCATC 58.2 ORS946-F CAAAACCAGCCATCTATCTCTCTTC 60.3 59 ORS946-R TTTGTGGGTCTCTCTCTACAAGGTT 60.3 ORS716-F CCCCACAACCCATAGCCTAA 59.8 57 ORS716-R GAACTAAC
22、CGCCATCCAAGA 57.8 ORS316-F TGGCGTCTTCATAGCATCAG 57.8 57 ORS316-R GAGATTTGAGCTTCGTGTTGC 58.0 ORS938-F ACCAACTCCCATGCAACCTAA 58.0 57 ORS938-R GCGTTCTCACCGTTCTAACACTT 60.2 ORS381-F CCAACGGTGATGTAACTAGGAA 58.2 57 ORS381-R GTTCTCCTGGATAGCTCGACA 60.0 ORS1073-F AGAGTGTTGGTCTTGATTTGTGG 58.4 57 ORS1073-R AAA
23、GAAAGGCGCACGTTAGTC 58.0 ORS965-F TTGGATTACCTTGGATAGTCAGC 58.4 57 ORS965-R CTTACCCTCCTCAGACCCTACCT 63.7 ORS12-F GCTTTGAGAAACCGCTTCAC 57.8 54 ORS12-R TTGATATGGTAACTAACGAACACAA 55.4 ORS836-F CACGAAATCGTTCCATTATTATGTT 55.4 54 ORS836-R GCAAGATAGTTTGATCAGGTAGCAA 58.7 ORS561-F CTTTGCACGTTGGTCATCAT 55.8 55
24、ORS561-R ACCAGCACCTTCCTCAACTG 59.8 ORS595-F TGATGGTAATGCATCGGGTA 55.8 55 ORS595-R CACACCATCCCTTGTAAAATCA 56.3 ORS725-F TCCGACGACCAAAGAAACTT 55.8 55 ORS725-R CACAATGAAGGGAAATGGAGA 56.1 ORS1064-F TGAATGATCTATGAGTGGTGATGG 58.6 58 ORS1064-R ACTCGCAGTGGTAAGTCGTTAGG 62.0 ORS899-F GCCACGTATAACTGACTATGACCA
25、60.3 58 ORS899-R CGAATACAGACTCGATAAACGACA 58.6 ORS1120-F TAACGTGTGCAGGTCTGTCTAAA 58.4 53 ORS1120-R TGCAAATAATAAGATAATGACCGATT 54.1 7 DB37/T 31042018 表A.1 引物及其参数 (续) 引物名称 序列(5to3) Tm 退火温度 ORS665-F GCACATGAGGTATGGATCTCCT 60.1 ORS665-R TGCAAATACAACTCGGGAAA 53.7 ORS420-F TCATGGTGTTTGGTTTGTGTC 56.1 ORS42
26、0-R TGCCAAATTCCTCTTCTTTCT 54.1 ORS432-F TGGACCAGTCGTAATCTTTGC 58.0 ORS432-R AAACGCATGCAAATGAGGAT 53.7 ORS1086-F TTGTTTGTCGCACACTCAAGATT 56.6 ORS1086-R ATTATCGGCACATCTTTGGATTT 54.8 ORS610-F TTGTGACCTTCTCCCTGCTC 59.8 ORS610-R AGGAAGCGAAACGAGGAAGT 57.8 ORS878-F TGCAAGGTATCCATATTCCACAA 56.6 ORS878-R TAT
27、ACGCACCGGAAAGAAAGTC 58.2 ORS530-F CACTTCATCCTCTCCCTCCTT 60.0 ORS530-R GGCGTGTGTGTTGGGTTATT 57.8 ORS795-F CGCTAGTTACACCGCAGATG 59.8 ORS795-R TGTCCACAGGTTGAAGATCG 57.8 ORS503-F TGAACCTTCAAACTTGCAATCA 54.5 ORS503-R AAACACACAACACAGGCAAGA 56.1 ORS644-F TCTGCGATACACACATCCAAA 56.1 ORS644-R GGGCTGTTAAAGGTGA
28、GATTCAA 58.4 ORS588-F CGGTTCTCTTTCTCACCTCAA 58.0 ORS588-R TCTCCCGTTCGGACTTCTC 59.7 ORS1178-F AGCTGACCATGTAAGGTTTGGTT 58.4 ORS1178-R ATTGTTGAGAGACGAGATGGATG 58.4 ORS691-F GCATCTGAGCAACTGCGTTA 57.8 ORS691-R ACCGTCCTTAGCTCTTGTGAG 60.0 ORS552-F CCATCCCTTCCCTCTCTTTC 59.8 ORS552-R GTGGCTGGAATCTCATCACC 59.
29、8 ORS1187-F AAAGATGTCAGTTTGTCCGTGTC 58.4 ORS1187-R CATCCACATTTCCCTTACACTCA 58.4 ORS1245-F GAAGTGGAGCAATGTTGGTGA 58.0 ORS1245-R CGCCAAGATATTAGTGTGATGATT 56.8 ORS1114-F AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG 60.2 ORS1114-R GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT 60.2 ORS733-F TATGAGTTGGCAAGGGCTTC 57.8 ORS733-R GGACTCCAACGAGAGAATCAG
30、T 60.1 ORS10-F CTCCACCACACAATCTCCG 59.7 ORS10-R TGTGGAGTTTGCCAGAACTG 57.8 8 DB37/T 31042018 表A.1 引物及其参数 (续) 引物名称 序列(5to3) Tm 退火温度 ORS340-F GGGCATAGTTTCCTCCGTTT 57.8 57 ORS340-R AAGTTCTCACGGTTCTTACAACTC 58.6 ORS1146-F GGCTCATCACTTGCATCTATTGT 58.4 57 ORS1146-R TGAAGACACCATCTCCAATGC 58.0 ORS397-F CAAAG
31、TCCCAAACCACAACC 57.8 57 ORS397-R GGGAAACAAGTTCCTTGATGG 58.0 ORS995-F CATGCTTTCTAGGATGGTCAGTT 58.4 57 ORS995-R TGTATGTGGAGGCCAACAAGTAT 58.4 ORS799-F TCCAGCAAGTCAGCAACAAC 57.8 57 ORS799-R ACTCCCTCCCATTCTCGTCT 59.8 ORS386-F TCCAGTTATCCAAAGGTGTGC 58.0 57 ORS386-R GTGCTAGAAGAACCTGTAACCATT 58.6 ORS1237-F
32、TTCCAGAAATTGGAGAGCAAA 54.1 53（+1 ） ORS1237-R GATTCTTAGCAAACGCAGAGG 58.0 ORS342-F TGTTCATCAGGTTTGTCTCCA 56.1 55 ORS342-R CACCAGCATAGCCATTCAAA 55.8 ORS351-F TGAAACGTAGTAACCTGCCAAA 56.3 55 ORS351-R TTGGACGACCTCGGTATCTT 57.8 ORS547-F TTGTCTTCATCTGCGTGTGA 55.8 55 ORS547-R TTGCTGTTGTTGATCGGTGT 55.8 ORS677
33、-F TCCTTCCTTCATTCTCTGCATT 56.3 55 ORS677-R CTCCATACCGTTGCCATCAT 57.8 ORS1179-F GATTCGGAGCTGTTAGGAGGTAG 62.0 56 ORS1179-R AAACGGGAAGCAAGAATAGAACA 56.6 ORS510-F CATCGCGTCCCTCTCTCTAA 59.8 57（- 1） ORS510-R CCAACCATCACAGCAATCAG 57.8 ORS911-F AAGGATCACTGGAAGAACAATGG 58.4 57（- 1） ORS911-R TAAACGCTTGTGACGGT
34、TAGTTG 58.4 ORS423-F TCATATGGAGGGATCTGTTGG 58.0 54（- 1） ORS423-R AAGCAACCATAATGCATCAGAA 54.5 ORS4-F ACAAGTCGGCTGGTGAGC 59.6 55 ORS4-R ACATGAAACACGAGCTAAACC 56.1 ORS810-F TTCAACGTGCGTGATTAAGG 55.8 55 ORS810-R GCGATTTCTTTGGAGACGAA 55.8 ORS57-F TTCCATTTCCACCATTTTGGC 56.1 55 ORS57-R CATTCATGGCCTAAAAGGTT
35、C 56.1 ORS1030-F CCTTTGATGTAGTTAAGGAAGTTGTG 58.8 56（- 1） ORS1030-R CGATCAATTTATATGACCGAATTACC 57.3 9 DB37/T 31042018 表A.1 引物及其参数 (续) 引物名称 序列(5to3) Tm 退火温度 ORS311-F TCCCGAATTAGCCAAAGAAC 55.8 55 ORS311-R GGTGTGGGTGTTGCAGCTAT 59.8 ORS609-F GCGAAGGAACTGAACCGATA 57.8 55 ORS609-R GGATTTTAGTCCGCCAATCA 55.8
36、 ORS488-F CCCATTCACTCCTGTTTCCA 57.8 57 ORS488-R CTCCGGTGAGGATTTGGATT 57.8 ORS301-F CGTGACCTGTGAAACACCAA 57.8 57 ORS301-R CGATAACCGTGTGAATCGTG 57.8 ORS343-F TCCACAAGGACCAACTACGA 57.8 57 ORS343-R TCCAACTGCACACACTCGAT 57.8 ORS750-F TCCATACCCACTGGCTGGAT 59.8 57 ORS750-R TGGAAGGATACTCTTTGCGTTG 58.2 ORS47
37、1-F CTTGCACGCAAAGAATAAAGC 56.1 55 ORS471-R CAAAGTTTTCTCATTTTAAGGGGTTT 55.7 ORS1240-F TTGAAAGTTGGGAGTGATGTTGT 56.6 56（- 1、+1 ） ORS1240-R AGTGTGATTGGTTGAGATTGGAA 56.6 ORS650-F TTAAGGGAAGCGTGATCTTCA 56.1 55 ORS650-R CCCATGATTGAGTTAGGGTGTT 58.2 ORS955-F CCTCCACATCCTACATAACCACA 60.2 57（- 1） ORS955-R TTGCCATCGAGAGTGTAAAGGTA 58.4 ORS703-F CCGCAGAATCCATCTAATCG 57.8 57 ORS703-R AGACGACATGATTGCCTGGT 57.8 ORS998-F GGTTGGGTTGGATACAAGTCG 60.0 58（- 1） ORS998-R TACCCTAACATCCTCCAATCGTTA 58.6 注1：引物合成时，附表引物在 F 端加通用接头：5 -CTCGTAGACTGCGTACCA-3 ，在 R 端加通用接头： 5-TACTCAGGACTCATCGTC-3，即可成为通用多重 PCR 引物 。 _ 10
