1、ICS 65.020.30 B 41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 31132018 猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测 技术规范 Antibodies Detection of Porcine Circovirus Type 2 with Colloidal Gold Immunochromatographic Assay 2018 - 02 - 02发布 2018 - 03 - 02实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 31132018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口
2、。 本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准起草人：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、徐绍建、于江、孙文博、丛晓燕、朱晓琳、韩红、 吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。 I DB37/T 31132018 猪圆环病毒2型抗体胶体金快速检测技术规范 1 范围 本标准规定了猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type 2，PCV2）的抗体胶体金试纸条制备方法 及试纸条使用规范。 本标准适用于猪圆环病毒2型的抗体快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括
3、所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与定义 下列术语与定义适用于本标准。 3.1 PVC板 聚氯乙烯板。 3.2 BSA 牛血清白蛋白。 3.3 NC膜 硝酸纤维素膜。 3.4 PBS 磷酸缓冲盐溶液。 4 材料及设备 4.1 主要仪器设备 4.1.1 微量移液器（最大量程分别为10 L、20 L、100 L、1000 L）。 4.1.2 20000 r/min低温高速离心机。 1 DB37/T 31132018 4.1.3 喷膜仪。 4.1.4 切条机。 4.1.5 PVC板。 4.1.6 0.22m无菌过滤器。 4.1.7 紫外分光光度计
4、。 4.1.8 电子天平 精度为：0.001 g。 4.2 主要试剂或材料 4.2.1 BSA：配制见附录A.1。 4.2.2 氯金酸：配制见附录A.2。 4.2.3 NC膜。 4.2.4 玻璃纤维膜。 4.2.5 吸水纸。 4.2.6 碳酸钾 分析纯。 4.2.7 猪圆环病毒2型Cap蛋白。 4.2.8 羊抗兔IgG。 4.2.9 1PBS溶液(pH值7.4)：配制见附录A.3。 4.2.10 超纯水：符合GB/T 6682，三级。 4.2.11 0.1mol/L Tris-HCL：配制见附录A.4。 4.2.12 Tween-20分析纯。 4.2.13 聚酯纤维膜。 5 免疫胶体金试纸条的
5、制备 5.1 胶体金的制备 所有试剂均需提前经0.22 m无菌滤器滤过。 5.1.1 用电炉加热99 mL超纯水至沸。 5.1.2 加入1 mL 1 %氯金酸溶液，继续加热3 min。 5.1.3 再缓慢加入2 mL 1 %柠檬酸钠溶液，边加入边用磁力搅拌器进行搅拌。 5.1.4 继续加热，颜色由灰色变为黑色，继而变为亮红色停止加热（约5 min）。 5.1.5 避光室温冷却后，用超纯水补足至100 mL。 5.1.6 用紫外分光光度计分别测其在520 nm和535 nm处的吸光度值，使其吸光度值在0.81.0之间 即可。 5.2 胶体金标记抗原和标记pH值 用0.2 mol/L碳酸钾将胶体金
6、溶液调节pH值为8.0后，加入纯化后的猪圆环病毒Cap蛋白，使其终浓 度为10 g/mL。 5.3 金标抗原的封闭和纯化 5.3.1 在金标溶液中加入羊抗兔（IgG），使其终浓度为1 mg/mL。 5.3.2 加入1/10体积的10 % BSA溶液（终浓度1%为封闭液）封闭，混匀并静置15 min。 5.3.3 4 ，8000 r/min离心20 min弃上清。 2 DB37/T 31132018 5.3.4 用原体积1/20且含有10 %蔗糖的0.1 mol/L Tris-HCL(pH值8.5)储存液重新悬浮沉淀。 5.4 玻璃纤维膜、聚酯纤维膜与NC膜的预处理 5.4.1 聚酯纤维膜（金标
7、结合垫）用Tween-20，37 浸泡30 min。 5.4.2 玻璃纤维膜（样品垫）、NC膜用封闭液37 浸泡30 min。 5.4.3 用1PBS溶液(pH值7.4) 分别对金标结合垫、样品垫和NC膜洗3次，37 干燥备用。 5.5 喷膜 5.5.1 用喷膜仪将标记Cap蛋白的胶体金以5 L/cm的喷涂量喷涂到金标结合垫上，37 干燥备用。 5.5.2 将纯化后的猪圆环病毒2型Cap蛋白稀释到1 mg/mL，用喷膜仪按1 L /cm的喷涂量喷涂到 NC膜的检测线（T-线）上，37 干燥备用。 5.5.3 将羊抗兔（IgG）稀释到1 mg/mL，用喷膜仪按1 L /cm的喷涂量喷涂到NC膜的
8、对照线（C- 线）上，37 干燥备用。 5.6 免疫胶体金试纸条的组装 5.6.1 将处理好的样品垫、胶体金结合垫、NC膜和吸水纸（吸水垫）从上到下粘贴在预先裁好的PVC 胶板上。 5.6.2 用切条机裁剪制作试纸条，宽度为6 mm，组装胶体金检测卡备用。 6 免疫胶体金试纸条的检测 将检测卡平放在桌面上，将待检血清样品3 滴4 滴（约80 L）加入加样孔（S）内，在室温内 静置15 min后，5 min之内判断结果。 7 结果和判定 7.1 对照线（C）出现一条紫红色线，试验成立。 7.2 试验成立条件下，判定结果： a) 检测线（T）处不出现红色线，则待检血清为猪圆环病毒2型抗体阴性； b
9、) 检测线（T）处出现一条颜色很浅的紫红色线，则待检血清为猪圆环病毒2型抗体弱阳性； c) 检测线（T）出现一条颜色较深的紫红色线，则待检血清为猪圆环病毒2型抗体阳性。 3 DB37/T 31132018 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 牛血清白蛋白（BSA）(10 %) 牛血清白蛋白 1 g。 灭菌超纯水定容至 10 mL。 A.2 氯金酸（1 %） 氯金酸 1 g。 灭菌超纯水定容至 100 mL。 A.3 1PBS溶液(pH 7.4) 磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27 g。 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42 g。 氯化钠(NaCl)：8 g。 氯化钾(KCl)：0.2 g。 加灭菌超纯水约 800 mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH值至7.4，最后定容到1 L。 A.4 0.1 mol/L Tris-HCL(pH 8.5) 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）：15.764 g。 加灭菌超纯水约900 mL充分搅拌溶解，然后加入氢氧化钠调pH值至8.5，最后定容到1 L。 _ 4
