1、ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省 地方标准 DB37/T 3128.2 2020 群禽腺病毒感染诊断技术 第 2 部分：血 清 4 型群禽腺病毒感染 PCR 和荧光定量 PCR 诊断技术 Diagnostic techniques for fowl adenovirus group I Part 2: Detection method on fowl adenovirus group I serotype 4 by PCR and quantitative real-time PCR 2020-06-08 发布 2020-07-08 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB3
2、7/T 3128.2 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。 DB37/T 3128.2 2020 1 群禽腺病毒感染诊断技术 第 2 部分：血清 4 型群禽腺病毒感 染 PCR 和荧光定量 PCR 诊断技术 1 范围 本标准规定了血清 4型群禽腺病毒聚合酶链式反应（ PCR）与实时荧光定量 PCR（ qPCR）检测方法 的范围、规范性引用文件、术语和定义、实验
3、室要求、样品、结果判定等。 本标准 所规定的血清 4型群禽腺病毒 PCR与实时荧光定量 PCR检测方法适用于检测鸡组织、分泌物、 排泄物和鸡胚尿囊液及细胞培养液中血清 4型群禽腺病毒的核酸，也适用于鸭、鹅及鸭胚、鹅胚尿囊 液血清 4型群禽腺病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量 控制规范动物检疫 3 术语和定义 下
4、列术语和定义适用于本文件。 3.1 血清 4型群禽腺病毒 Fowl adenovirus group I Serotype 4 是引起禽心包积水 -肝炎综合征的病原，主要造成 3周龄 5周龄家禽突然死亡，并伴随有心包积水 和肝炎。 3.2 实时荧光定量 PCR Quantitative Real-time PCR（ qPCR） 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对 PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结 合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。 4 实验室要求 4.1 环境 4.1.1 实验 室符合 GB19489 和 GB/T 27401 要求，实验室必须为
5、生物安全级（ BSL-2 级）及以上实验 室。 DB37/T 3128.2 2020 2 4.1.2 从事 PCR 工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、电 泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单一流向，不得倒流。特别注意电泳后的琼脂凝胶要及时处理， 避免对实验室造成污染。 4.1.3 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品收集高压灭菌后，送有资质的医 用垃圾处理公司做处理。 4.2 人员 操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理、细胞培养和分子生物学实验室检测技术培训。 熟悉生物样品处理、细胞培养、以及核酸提取、基因扩增等分子生物学技术，熟
6、悉 PCR与 qPCR检测结果 的判断方法。 4.3 仪器设备 4.3.1 生物安全柜。 4.3.2 PCR 仪（温度差小于 0.3 ）。 4.3.3 台式低温高速离心机（最大转速为 15000 rpm）。 4.3.4 电泳仪。 4.3.5 电泳槽。 4.3.6 紫外凝胶成像仪。 4.3.7 冰箱： 2 8 。 4.3.8 冰柜： -20 。 4.3.9 微量移液器（最大量程分别为 10 L、 20 L、 100 L、 1000 L），带滤芯的枪头。 4.3.10 电子天平：精度为 0.001 g。 4.3.11 电磁炉或微波炉。 4.3.12 荧光定量 PCR 仪。 4.4 试剂或材料 除另
7、有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682规定的一级水。 4.4.1 DNA 提取试剂盒。 4.4.2 rTaq DNA 聚合酶： 5U/ L。 4.4.3 10 PCR 缓冲液。 4.4.4 dNTPs： 2.5 mmol/L, 10 mmol/L。 4.4.5 荧光定量 PCR 试剂盒。 4.4.6 1.5%琼脂糖凝胶，见附录 A.1。 4.4.7 1 TAE 缓冲液，见附录 A.2。 4.4.8 溴化乙锭（ 10 g/ L），见附录 A.3。 4.4.9 核酸电泳加样缓冲液，见附录 A.4。 4.4.10 DNA 分子量标准，要求在 100 bp 2000 bp 之间，
8、有 5 条以上的指示条带。 4.4.11 阳性对照标准品，已知的血清 4 型群禽腺病毒 SPF 鸡胚尿囊液。 4.4.12 阴性对照标准品，经高压灭菌的超纯水。 DB37/T 3128.2 2020 3 4.4.13 PCR 检测所需引物： 上游引物 F： 5 -CTCTTCGACCTCGTGTCTTACA-3； 下游引物 R： 5 -TTTACACGGCGTTGCCTGT-3，扩增片段长度为 568bp，引物浓度为 100 mol/L。 4.4.14 荧光定量 PCR 检测所需引物： 上游引物 1983F： 5 -CGTCAACTTCAAGTACTC-3； 下游引物 2068R： 5 -AG
9、AGGATGCTCATGTTAC-3； 探针 P： 5 FAM-CCTACTCAGATGGAGGCTTCTACC-TAMRA3，扩增片段长度为 86bp，引物浓度为 100 mol/L。 5 样品 5.1 样品采集与运输 采集疑似血清 4型群禽腺病毒感染死亡家禽的肝脏、脾脏和肾脏等组织样品，进行分别处理或同 时处理；活禽采集泄殖腔拭子。样品置于在密闭容器中冷藏运输，储藏温度不超过 4 ，时间不超过 24 h。 5.2 样品保存 5.2.1 样品应放在含有抗生素的 pH 值 7.0 7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（ PBS，附录 A.5）内。 5.2.2 抗生素的选择应视当地情况而定，组织和咽喉拭子
10、悬液中应含有青霉素（ 2000 IU/mL）、链霉 素（ 2 mg/mL）、庆大霉素（ 50 g/mL）和制霉菌素（ 1000 IU/mL），加入抗生素后 pH 值应调至 7.0 7.4。 5.2.3 在室温放置 1 h 2 h 内样品应尽快处理，不能处理的可在 4 存放，不超过 24 h。 5.2.4 组织研磨液和泄殖腔拭子悬液置于 -20 低温条件下保存，不超过 2 wk； -70 贮存不超过 30 d。 5.3 样品处理 5.3.1 在生物安全柜中进行样品处理，取 10 g 20 g 样品放入灭菌的研钵中磨碎。 5.3.2 咽喉或泄殖腔拭子 ，置于 200 L 含有青霉素（ 2000 I
11、U/mL）、链霉素（ 2 mg/mL）、庆大霉素 （ 50 g/mL）和制霉菌素（ 1000 IU/mL）的 pH 值 7.0 7.4 等渗磷酸盐缓冲液中。 5.3.3 研磨充分的组织用含青霉素（ 2000 IU/mL），链霉素（ 2 mg/mL）、庆大霉素（ 50 g/mL）和制 霉菌素（ 1000 IU/mL） pH 值 7.0 7.4 的等渗 PBS 溶液配制成 10% 20%（ g/mL）的悬液。样品经 8000 r/min 离心 10 min，取上清液作为材料，进行后续试验。 5.4 对照设置 每次检测，用相应的阳性对 照标准品或阴性对照标准品，至少设置一个或一个以上的阴性对照和阳
12、性对照。 5.5 DNA 提取 按照 DNA提取试剂盒说明书，提取样品和对照组的 DNA。提取的 DNA应立即检测，否则应置于 -70 冻存。 5.6 PCR 反应 5.6.1 PCR 的反应体系 DB37/T 3128.2 2020 4 10 PCR Buffer 2.5 L, dNTPs（ 2.5 mmol/L） 2 L，引物 F（ 100 mol/L）和 R（ 100 mol/L） 各 0.5 L，模板 DNA 3 L， rTaq DNA聚合酶 0.25 L，加超纯水至 25 L。 5.6.2 PCR 反应条件 94 预变性 5 min； 94 30 s， 53 30 s， 72 30
13、s， 30个循环； 72 延伸 10 min。 5.6.3 琼脂糖凝胶电泳 PCR反应结束后，取 9 L样品与 1 L核酸电泳加样缓冲液混匀后，与 1.0%琼脂糖凝胶中电泳，在位 于凝胶中央的孔加入 DNA分子量标准。加样后，按照 5 V/cm电压，电泳 30 min。电泳后，置于凝胶成像 仪观察，根据分子量标准判断 PCR扩增产物大小。 5.7 实时荧光定量 PCR 反应 5.7.1 实时荧光定量 PCR 反应体系 Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 L， Rox Reference Dye II 0.2 L，引物 1983F（ 100 mol/L） 和引物 2068
14、R（ 100 mol/L）各 0.4 L，探针 P（ 100 mol/L） 0.4 L，模板 DNA 2 L，加 ddH2O至 20 L。 反应液混匀后置于 ABI 7500型荧光定量 PCR仪进行扩增。 5.7.2 实时荧光定量 PCR 反应条件 95 预变性 30 s； 95 变性 5 s， 62 退火 32 s（收集信号），进行 40个循环。 6 结果判定 6.1 阳性对照出现相应大小的扩增条带或扩增曲线，且阴性对照无扩增条带或扩增曲线时，判定检测 结果有效。 6.2 血清 4 型群禽腺病毒 PCR 产物大小为 568bp。阳性对照出现 568bp 扩增条带，阴性对照无条带 出现（引物二
15、聚体除外）时试验成立。被检样品出现 568bp 条带为血清 4 型群禽腺病毒阳性，否则为 阴性（附录 B.1）。 6.3 血清 4 型群禽腺病毒荧光定量 PCR 阳性对照出现 S 型扩增曲线，且 Ct 值小于 35，阴性对照无 S 型扩增曲线，且 Ct 值大于 35 时试验成立。被检样品出现 S 型扩增曲线，且 Ct 值小于 35 为血清 4 型 群禽腺病毒阳性，否则为阴性（附录 B.2）。 DB37/T 3128.2 2020 5 A A 附 录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 1.5%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.5 g 0.5TAE 电泳缓冲液加至 100 mL 微波炉中完全
16、融化，待冷至 5060时加入溴化乙锭（ EB）溶液 5 L，摇匀。倒入板上凝固后， 取下梳子，备用。 A.2 1TAE电泳缓冲液的配制 A.2.1 配制 0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（ EDTA-Na2）溶液（ pH 8.0） 乙二胺四乙酸钠（ EDTA-Na2 2H2O） 18.61 g 灭菌双蒸水 80.0 mL 氢氧化钠调 pH 至 8.0 水加至 100 mL 用于配制 A.2.2中的 50TAE电泳缓冲液 A.2.2 配制 50TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（ Tris） 242 g 冰醋酸 57.1 mL 0.5mol/L 乙二胺四乙酸钠（ EDTA-Na2）溶液（ pH 8
17、.0） 100 mL 水加至 1000 mL 用于配制 A.2.3中的 1TAE电泳缓冲液 A.2.3 配制 1TAE电泳缓冲液 50TAE 电泳缓冲液 20 mL 水加至 1000 mL A.3 溴化乙锭的配制 溴化乙锭 20 mg 水加至 20 mL A.4 核酸电泳加样缓冲液（ 10） 聚蔗糖 25 g 灭菌双蒸水 100 mL DB37/T 3128.2 2020 6 溴酚蓝 0.1g 二甲苯青 0.1 g A.5 磷酸盐缓冲液（ PBS， 0.01mol/L pH 7.4） NaCl 8.0 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g Na2HPO4.12H2O 0.2 g 水加至 1000 mL DB37/T 3128.2 2020 7 B B 附 录 B （规范性附录） 试验结果图示 B.1 PCR产物大小对照 M为分子量标准； 1为阳性对照， N为阴性对照 图 B.1 PCR 产物大小对照图 B.2 荧光定量 PCR扩增曲线 1为阳性对照， 2为阴性对照 图 B.2 荧光定量 PCR 扩增曲线 _
