1、ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 30862017 猪附红细胞体PCR检测技术 PCR Assay for Detection of Swine Eperythrozoon 2017 - 12 - 29发布 2018 - 01 - 29实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 30862017 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭
2、立辉、于江、吴家强、李俊、 时建立。 I DB37/T 30862017 猪附红细胞体PCR检测技术 1 范围 本标准规定了猪附红细胞体PCR 检测技术的 操作要求 本标准适用于猪附红细胞体的实验室诊断、监测和流行病学调查等。 2 实验室生物安全要求 实验室必须为生物安全级（BSL -2级）及以上实验室。 3 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 4 术语与定义 下列术语与定义适用于本标准。 4.1 PCR
3、 聚合酶链式反应。 4.2 SDS 十二烷基硫酸钠。 5 仪器设备和试剂 5.1 仪器设备 5.1.1 微量移液器（最大量程分别为 10 L、20 L、100 L 、1000 L），带滤芯的枪头。 5.1.2 20000 r/min 低温高速离心机。 5.1.3 电热恒温水槽。 5.1.4 稳流稳压电泳仪。 5.1.5 水平电泳槽。 5.1.6 凝胶成像系统。 5.1.7 紫外透射反射分析仪。 5.1.8 电磁炉。 5.1.9 烧杯（ 1000 mL）。 1 DB37/T 30862017 5.1.10 电子天平 精度为：0.001 g。 5.1.11 PCR 扩增仪。 5.1.12 -20
4、冰柜。 5.1.13 2 8 冰箱。 5.2 试剂 除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。 5.2.1 蛋白酶 K（见附录 A.1）。 5.2.2 10 %SDS 液（见附录 A.2）。 5.2.3 70 %乙醇（见附录 A.3）。 5.2.4 1.0 %琼脂糖凝胶（见附录 A.4）。 5.2.5 DNA Marker DL2000。 5.2.6 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。 5.2.7 引物： MS-Fwd：5- CGAGCGCAACCCTTCATAT-3； MS-Rev：5- CTACCATTGTAGCACGTTTGCA-3； 扩增片段大小127 bp 。 6 操作程序 6.1
5、 样品的采集和处理 6.1.1 样品的采集 临床上猪的血液（肝素抗凝血），置于2 8 冰箱保存。 6.1.2 样品的处理 6.1.2.1 取肝素抗凝血液约 5 ml。 6.1.2.2 阳性对照处理：猪附红细胞体 DNA。 6.1.2.3 阴性对照处理：灭菌双蒸水。 6.2 DNA的提取 用蛋白酶K 裂解法提取总 DNA。 6.2.1 取肝素抗凝血 500 L 于 1.5 mL 离心管中，加入 50 g/mL 的蛋白酶 K 5 L，加入 10 %的 SDS 溶液 25 L ，55 水浴 2 h3 h。 6.2.2 加入 200 L Tris 饱和酚，充分混匀， 10000 g 离心 15 min
6、。 6.2.3 取上清于一新的离心管中，加入 200 L Tris 饱和酚和 200 L 氯仿，10000 g 离心 15 min。 6.2.4 取上清于一新离心管中，加入 200 L 氯仿，10000 g 离心 15 min。 6.2.5 取上清于一新离心管中，加入 2 倍体积的无 水乙醇， -20 静置 20 min，10000 g 离心 15 min， 弃上清。 6.2.6 加入 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 6.2.7 加入 100 L 灭菌双蒸水溶解沉淀， -20 保存备用。试验中同时设立猪附红细胞体 DNA 作为 阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。 6.3 PC
7、R 2 DB37/T 30862017 PCR为50 L体系，按表 1中17 的循序配制。 表1 PCR反应体系（50L） 序号 体系组成 体系含量 1 灭菌双蒸水 37.5 L 2 DNA 4 L 3 10 mmol/L上游引物 0.5 L 4 10 mmol/L下游引物 0.5 L 5 10PCR Buffer 5 L 6 2.5 mmol/L dNTPs 2 L 7 Taq酶 0.5 L 首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬， 瞬时离心，使液体都沉降到PCR 管底。循环参数为 95 5 min ， 94 30 s ， 52 45 s， 72
8、 1 min， 循环30 次， 72 延伸 10 min结束。 6.4 电泳 6.4.1 制备 1.0 %琼脂糖凝胶板，见附录 A.4。 6.4.2 取 5 L PCR 产物与 0.5 L 加样缓冲液混合，加入琼脂 糖凝胶板的加样孔中。 6.4.3 加入分子量标准。 6.4.4 盖好电泳仪，插好电极， 5 V/cm 电压电泳， 3040 min。 6.4.5 用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。 6.4.6 用分子量标准比较判断 PCR 片段大小。 7 结果判定 7.1 在阳性对照出现 127 bp 扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立（参见附录 A.5）。 7.2 被检样品出现 127 b
9、p 扩增带判定为猪附红细胞体阳性，未出现相应扩增带的样品判定为猪附红细 胞体阴性（参见附录 A.6）。 3 DB37/T 30862017 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶K溶液（20 mg/mL） 试剂名称 用量 蛋白酶 K 100 mg 灭菌双蒸水 5 mL A.2 10%十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2） 试剂名称 用量 十二烷基硫酸钠 10 g 灭菌双蒸水 80 mL 浓盐酸 调 pH 至 7.2 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.3 70 %乙醇 试剂名称 用量 无水乙醇 70 mL 灭菌双蒸水 30 mL A.4 1.0%琼脂糖凝胶 试剂名称 用量 琼脂糖 0.6 g 0.5TBE 缓冲液 60 mL _ 4
