1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 31272018 禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体 检测技术规范 Technical Guideline of Agglutination Test and Indirect ELISA for Antibody Detection of Bordetella avium 2018-02-02发布 2018-03-02实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 31272018 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。
2、本标准主要起草单位：山东农业大学、山东省动物疫病预防与控制中心。 本标准主要起草人：朱瑞良、魏凯、胡莉萍、黄河、杨萍萍、柳洪洁、刘红红、王敏。 I DB37/T 31272018 禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术规范 1 范围 本规范规定了禽波氏杆菌凝集试验和间接ELISA抗体检测技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设 备，利用平板凝集试验、试管凝集试验和间接酶联免疫吸附实验（iELISA）检测禽波氏杆菌抗体的方法 和技术要求。 本规范适用于禽场禽波氏杆菌的流行病学调查、诊断和疫情监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版
3、本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14925 实验动物 环境及设施 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽波氏杆菌 Bordetella avium, B. avium 是波氏杆菌属（The genus Bordetella）四个种中的一个新种，1984年由Kersters确认。 3.2 试管凝集试验 tube agglutination test 常用已知已定量的抗原与一系列稀释的禽的血清混合，在保温放置后
4、观察结果，以判定受检血清有 无相应抗体及其效价。多用于半定量和定量试验。 3.3 间接酶联免疫吸附实验 indirect enzyme-linked immunosorbent assay, iELISA ELISA是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技 术。iELISA是基于ELISA反应原理设计的，包被抗原后加入待测抗体，反应后洗板，加入酶标二抗，反 应后再洗板，加入底物显色。 4 试剂或材料 4.1 禽波氏杆菌标准株 1 DB37/T 31272018 禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。 4.2 禽波氏杆菌阳性血清 SPF鸡经免疫禽波氏杆
5、菌抗原三次后获得的血清，每次免疫间隔两周。 4.3 阴性血清 从SPF鸡分离的血清。 4.4 待检禽血清 采集禽的血液，于37 温箱中静置2 h，收集析出的血清。 4.5 生化试剂 灭菌0.5 %石炭酸生理盐水、PBS、PBST、Tris-HCl、牛血清白蛋白（BSA）、底物反应液（具体配 制方法见附录A）。 5 仪器设备 5.1 平板（玻板、白瓷板或载玻片）。 5.2 微量移液器：量程为20 L100 L。 5.3 接种环。 5.4 试管架。 5.5 小试管（口径8 mm10 mm）。 5.6 灭菌吸管（1 mL）。 5.7 恒温培养箱。 5.8 匀速振荡器。 5.9 96孔ELISA酶标板
6、。 5.10 酶标仪（波长范围340 nm850 nm）。 6 禽波氏杆菌抗体检测平板凝集试验 6.1 用20 L微量移液器分别吸取三滴禽波氏杆菌P5株标准抗原于平板上。 6.2 再分别取禽波氏杆菌阳性抗体、阴性血清和待检禽血清各一滴加入上述抗原液中，并用接种环混 合均匀，3 min5 min观察结果。 6.3 平板凝集试验可参考图1： 2 DB37/T 31272018 图1 平板凝集试验图示 6.4 结果判定： 6.4.1 阳性血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，阴性血清与阳性抗原作用后仍均匀混浊，试验结 果有效。 6.4.2 待检禽血清与阳性抗原作用后出现明显凝集颗粒，则判为阳性。 6
7、.4.3 待检禽血清与阳性抗原作用后均匀混浊，则判为阴性。 6.4.4 待检禽血清与阳性抗原作用后介于阴阳性之间，判为可疑。 7 禽波氏杆菌抗体检测试管凝集试验 7.1 被检禽血清稀释度设定 通常情况下，用1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度；大规模检疫时，可只用前两个稀释度。 7.2 血清的稀释及抗原的加入 7.2.1 血清的稀释 7.2.1.1 为每份血清准备小试管5支，第一管加入2.3 mL石炭酸生理盐水，第二管不加，第三、四、 五管各加入0.5 mL石炭酸生理盐水。 7.2.1.2 用1 mL吸管吸取被检血清0.2 mL，加入第一管中，并混合均匀，然后用吸管吸取混合液0
8、.5 mL， 加入到第二管中，混合均匀，再吸取混合液0.5 mL加入到第三管，同样混匀，从中吸取0.5 mL加入第 四管混匀，再从第四管吸取0.5 mL加入第五管，第五管混匀后弃去0.5 mL。这样稀释之后，从第二管 到第五管，血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50、1:100。 7.2.2 加入抗原 先用含0.5 %石炭酸生理盐水，将抗原原液作20倍稀释，然后从第二管起每管加入抗原稀释液0.5 mL （第一管不加，作血清蛋白凝固对照），振荡均匀。加入抗原后，第二至第五管各管混合液的容积均为 1 mL，血清稀释度依次变为1:25、1:50、1:100、1:200。 7.2.3 对照管
9、的制作 每次试验均须作阳性血清（Ab + ）对照、阴性血清（Ab - ）对照、抗原（Ag + ）对照。 试管凝集试验操作过程可参考表1： 表1 试管凝集试验方法 试 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 血清终稀释度 1:12.5 1:25 1:50 1:100 1:200 Ag + 对照 A b + 对照 Ab - 对照 0.5%石炭酸生理盐水 2.3 0.5 0.5 0.5 0.5 0.2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5(Ab + ) 0.5(Ab - ) 舍去0.5 待检血清 阳性抗原（1:20） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 3 DB37/T
10、 31272018 7.2.4 凝集反应 全部试管于匀速振荡器充分振荡后置于37 38 温箱中22 h24 h，然后检查并记录结果。 7.3 结果判定 7.3.1 判定依据 根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。 7.3.2 凝集程度判定标准 100 %抗原凝集（+）：抗原全部凝集，呈伞状沉于管底，上清液完全清亮透明； 75 %抗原凝集（+）：约有3/4的抗原被凝集，管底凝集物与+相同，只是上清液稍混浊； 50 %抗原凝集（+）：约1/2的抗原被凝集，管底有中等量的凝集物，上清液混浊半透明； 25 %抗原凝集（+）：约1/4的抗原被凝集，管底有少量凝集
11、物，上清液完全混浊不透明； 0 %抗原凝集（-）：抗原完全未凝集，上清液完全混浊不透明，但由于菌体抗原自然下沉，在管底 中央出现规则的菌体自沉圆点。 试管底部凝集程度判定可参考图2： 图2 试管底部凝集现象图示 7.3.3 凝集价判定 能使50 %抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清凝集价（或称滴度）。 7.3.4 待检血清样本结果判定标准 血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性；血清凝集价为1:25，判为疑似反应。疑似反应者，3周后 须重新采血，再次进行试验，如果仍为疑似反应时，可判为阳性。 8 禽波氏杆菌间接酶联免疫吸附实验（iELISA）抗体检测方法 8.1 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的
12、提取 8.1.1 将保存的禽波氏杆菌株接种于200 mL肉汤培养基中，37 振荡培养过夜后，离心收集过夜培 养的细菌。 8.1.2 用10倍体积的含有10 mM MgCl2的Tris-HCl（100 mM pH7.8）缓冲液悬浮，超声波破碎（功率 为500 W、破碎时间60 s、间隙60 s、反复破碎10次）。 8.1.3 通过1000g低速离心去除细胞核，上清液高速离心，10000 g，20 min。 8.1.4 含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含2 % Triton X-100的Tris-MgCl2缓冲液溶解，室温下孵育 30 min降解内膜蛋白后，再进行100000g，30 min超速离心。
13、 8.1.5 沉淀用缓冲液再悬浮，置-20 保存备用。 4 DB37/T 31272018 8.2 禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备 8.2.1 将提取的禽波氏杆菌OMP蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备 禽波氏杆菌OMP免疫用抗原。. 8.2.2 选取体重1 kg以上的健康鸡4只，肌肉注射免疫OMP抗原，共免疫4次，每次间隔1周，OMP 免疫剂量为320 g/只/次。实验鸡的饲养符合GB 14925的要求。 8.2.3 最后1次免疫后7 d采血，用上述试管凝集试验检测血清中鸡抗禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝 集价高于1:256以上时采血，分离血清，-20
14、 保存备用。 8.3 阴性血清制备 采集SPF鸡的血液，制备阴性血清。 8.4 间接酶联免疫吸附实验（iELISA）检测方法 8.4.1 包被 将禽波氏杆菌OMP用包被液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释成10 g/mL，包被酶标板。 8.4.2 封闭 用PBST洗涤酶标板5次。每孔加入封闭液（含1 BSA的PBS）200 L，置湿盒内，4 封闭过夜。 8.4.3 加一抗 用PBST洗涤酶标板5次。取1孔加入1:10倍稀释鸡抗禽波氏杆菌高免血清（作阳性对照），取1孔加 入1:10倍稀释的鸡阴性血清（作阴性对照）；其它孔加1:10稀释的待检血清，置湿盒内37 作用60 min。
15、 抗体稀释液为1 BSA的PBS。 8.4.4 加二抗 用PBST洗涤酶标板5次。加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鸡IgG（抗体稀释液为1 BSA的PBS）， 置湿盒内37 作用45 min。 8.4.5 底物显色 用PBST洗涤酶标板5次。加底物反应液，置湿盒内37避光显色20 min。 8.4.6 读数 用2 mol/L的H 2SO4溶液终止反应，用酶标仪检测反应孔的OD490值。 8.4.7 结果判定 以待测孔的OD值大于或等于阴性对照孔的2倍者，即P/N大于或等于2判为阳性，重复3次计算平均值。 5 DB37/T 31272018 A A 附 录 A （资料性附录） 溶液的配置
16、A.1 试管凝集试验中灭菌0.5%石炭酸生理盐水的配制 称取9 g氯化钠（NaCl）溶于水，定容到1 L，再加入5 mL苯酚。配制后高压灭菌器灭菌后使用。 A.2 禽波氏杆菌间接酶联免疫吸附实验中相关试剂的配制 A.2.1磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 1 mol/L PBS（pH 7. 2）的配方： 氯化钠（NaCl） 8.0 g 氯化钾（KCL） 0.2 g 磷酸氢二钠（Na 2HPO4） 1.44 g 磷酸二氢钾（KH 2PO4） 0.24 g 双蒸水（H 2O） 定容至1000 mL A.2.2 PBST缓冲液的配制 1 L PBS + 1 mL Tween-20 A.2.3 牛血清白蛋
17、白（BSA） 将100 mg的牛血清白蛋白加入9.5 mL水中（须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白中），盖好盖 后，轻轻摇动，直至牛血清白蛋白完全溶解为止。加水定容到10 mL，然后分装成小份，贮存于-20 。 A.2.4 Tris-Hcl缓冲液的配制 Tris 碱 121.1 g 浓盐酸（1mol/L HCl） 42.0 mL 双蒸水 定容至1000 mL 在900 mL双蒸水中加入121.1 g Tris 碱，溶液冷却至室温后调节溶液pH值至8.0，然后定容至 1000 mL，分装后1.03410 5 高压灭菌30 min，室温保存。 A.2.5 底物反应液的配制 取10 mL磷酸盐柠檬酸缓冲液，加邻苯二胺（OPD）4 mg和3 % H2O2 15 L。 实验室用水应符合GB/T 6682的要求。试验中配制试剂应符合GB/T 603的要求。 6 DB37/T 31272018 _ 7
