1、ICS 11.220 B 41 DB37 山东省地方标准 DB37/T 29952017 副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术 Technology of Real-time PCR Assay In Haemophilus parasuis 2017-08-18发布 2017-09-18实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 29952017 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：吴家强、于江、郭立辉、张玉玉、杜
2、以军、李俊、陈蕾、陈智、孙文博、丛晓 燕、时建立、王金宝。 本标准为首次发布。 I DB37/T 29952017 副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测技术 1 范围 本标准规定了副猪嗜血杆菌荧光定量 PCR检测技术的要求。 本标准适用于猪血液、组织及细菌培养物中副猪嗜血杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Ct值 Cycle thresho
3、ld 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数 。 4 缩略语 下列缩略语 适用于本文件。 HPS：副猪嗜血杆菌（ Haemophilus parasuis） 5 仪器与试剂 除非另有说明，在检测中使用的化学试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T 6682 的要求。 5.1 微量可调 移液器（最大量程为 10 L、20 L、100 L、1000 L）。 5.2 高速冷冻离心机。 5.3 荧光定量 PCR 仪 。 5.4 水浴锅。 5.5 恒温培养箱。 5.6 -20 冰箱。 5.7 二级生物安全柜。 5.8 超低温冰箱：可控温至-70 。 5.9 10 mL 抗凝采血管。 5.
4、10 一次性无菌 5 mL 注射器。 1 DB37/T 29952017 5.11 1.5 mL 无 RNA 酶离心 管 。 5.12 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管 。 5.13 PBS 缓冲液。 5.14 SYBR Green 核酸染料 （含酶）。 5.15 蛋白酶 K（见附录 A.1）。 5.16 10%SDS 液（见附录 A.2）。 5.17 70%乙醇（见附录 A.3）。 5.18 引物： P1： 5-ACCAGAAGCAAACCCAGAGC-3，P2 ：5- ACACCGCTTGCCATACCCTC-3。 5.19 标准阳性对照： HPS infB 基因阳性质粒。 5.20
5、标准阴性对照：无菌超纯水。 6 方法 6.1 样品采集 6.1.1 活体采样：无菌采集抗凝血。 6.1.2 病死猪采样：无菌采集心包积液或胸腔积液或肺脏组织。 6.1.3 细菌培养物：37 培养 24 h48 h 的细菌培 养物。 6.2 样品处理 6.2.1 组织样品处理： 取肺脏组织 3 g5 g 于研钵中，用灭菌剪刀剪碎，加入 2 mL PBS 缓冲液，研 磨。 6.2.2 细菌培养物处理：挑取 3 4 个细菌单菌落加入 100 L 灭菌水中，煮沸 10 min 后，再放置 -20 冻结。冻融后， 10000 r/min 离心 5 min，取上清作为 DNA 模板， -20 保存备用。
6、6.3 核酸提取 6.3.1 取样品 500 L 于 1.5 mL 离心管中，加入 50 g/mL 的蛋白酶 K 5 L，加入 10 %的 SDS 溶液 25 L，55 水浴 2 h 3 h。 6.3.2 加入 200 L Tris 饱和酚，充分 混匀， 10000 r/min 离心 15 min。 6.3.3 取上清于一新的 离心管中，加入 200 L Tris 饱和酚和 200 L 氯仿，10000 r/min 离心 15 min。 6.3.4 取上清于一新离心管中，加入 200 L 氯仿， 10000 r/min 离心 15 min。 6.3.5 取上清于一新离心管中，加入 2 倍体积的
7、无水乙醇， -20 静止 20 min，10000 r/min 离心 15 min，弃上清。 6.3.6 加入 70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。 6.3.7 加入 100 L 灭菌超纯水溶解沉淀， -20 保存备用。 6.4 荧光定量PCR反应体系 荧光定量PCR 反应体系 ，详见 附录 B.1。 6.5 荧光定量PCR程序设定 每次PCR 均应设阳性对照与阴性对照，具体参数见附录 B.2。 7 结果判定 2 DB37/T 29952017 7.1 试验成立条件 7.1.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 7.1.2 阳性对照 Ct 值 30，并出现特定扩增曲线，否则，此
8、试验视为无效。 7.2 判定 7.2.1 阴性 Ct值 35，表明样品为阴性。 7.2.2 阳性 Ct值 30，且出现特定扩增曲线，表明样品中存在 HPS。 7.2.3 疑似 30 Ct值 35的样品须重检，结果仍然在该区间，判定为阳性。 3 DB37/T 29952017 A A 附 录 A （资料性附录） 试剂的配制 A.1 蛋白酶K溶液(20 mg/mL) 蛋白酶 K 100 mg 灭菌双蒸水 5 mL A.2 10 %十二烷基硫酸钠（SDS溶液，pH7.2） 十二烷基硫酸钠 10 g 灭菌双蒸水 80 mL 浓盐酸 调 pH至7.2 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.3 70 %乙醇
9、 无水乙醇 70 mL 灭菌双蒸水 30 mL 4 DB37/T 29952017 B B 附 录 B （规范性附录） 荧光定量PCR反应体系和程序 B.1 荧光定量PCR反应体系 表B.1 荧光定量PCR反应体系 组分 反应体系 SYBR Green 核酸染料 12.5 L 引物 P1 1.0 L 引物 P2 1.0 L DNA 模板 2.0 L 灭菌水 8.5 L 总量 25.0 L B.2 荧光定量PCR反应程序 表B.2 荧光定量PCR反应程序设定 温度 时间 步骤 1 95 10 min 步骤 2（40 个循环） 95 10 s 58 收集信号 10 s 步骤 3 95 2 min 60 20 s 95 Continue _ 5
