1、ICS 65.120 B 46 DB37 山东省地方标准 DB 37/ T 21402012 预混合饲料中维生素B 1 、B 2 、B 6 和烟酰胺 的同步测定 高效液相色谱法 Determination of vitamin B 1 、 B 2 、 B 6 and niacinamide in feed High performance liquid chromatography 2012 - 05 - 14 发布 2012 - 07 - 01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 21402012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧
2、业专业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：山东省饲料质量检验所。 本标准主要起草人：强莉、李桂华、刘雪芹、李俊玲、战余铭、张玮、王现杰。 DB37/T 21402012 1 预混合饲料中维生素B 1 、B 2 、B 6 和烟酰胺的同步测定高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了用高效液相色谱仪同步测定预混合饲料中维生素B 1、维生素B 2、 维生素B 6和烟酰胺的 方法。 本标准适用于维生素预混合饲料和复合预混合饲料中维生素B 1、维生素B 2、 维生素B 6和烟酰胺的测 定。 本方法最低定量限维生素B 1、维生素B 6、烟酰胺为40 mg/kg，维生素 B 2为10 mg/kg。 2
3、 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试料中的维生素B 1、维生素B 2、维生素B 6和烟酰胺用盐酸溶液提取、过膜后，在高效液相色谱反相 柱上分离，紫外检测器280nm处测定，外标法定量。 4 试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。试剂包括： a) 乙腈：色谱纯； b) 三氟乙酸：色谱纯； c) 冰
4、乙酸：优级纯； d) 盐酸； e) 氢氧化钠； f) 盐酸溶液：c(HCl)=0.5 mol/L。量取 45 mL 的盐酸注入 1000 mL 的水中； g) 盐酸溶液：c(HCl)=0.1 mol/L。量取 9 mL 的盐酸注入 1000 mL的水中； h) 氢氧化钠溶液：c(NaOH)=2 mol/L。称取 8g 氢氧化钠,溶于 100 mL 水中； i) 0.1三氟乙 酸溶液：准确吸取三氟乙酸 1.00 m L 于1000 mL容量瓶，用水定容，摇匀； j) 流动相：乙腈和 0.1三氟乙酸溶液； k) 维生素B 1、维生素B 2、 维生素B 6和烟酰胺标准品：纯度大于 98； l) 标准
5、贮备溶液，操作步骤如下： DB37/T 21402012 2 1) 维生素B 1标准贮备溶液：准确称取维生素B1 标准品 0.0200 g 于 100 mL棕色容量瓶中， 加 0.1 mol/L 盐酸溶液溶解，超声 15 min，待全部溶解后，用 0.1 mol/L盐酸溶液定容 至刻度，此溶液浓度为 200 g/mL。避光操作。置 2 8 冰箱保存，保质期 3个月； 2) 维生素B 2标准贮备溶液：准确称取维生素B2 标准品 0.0200 g 于 100 mL棕色容量瓶中， 加 5 mL 2 mol/L 氢氧化钠溶液溶解，超声使其全部溶解后，加约 60 mL水，再加 2.5 mL 冰乙酸，用水
6、定容至刻度，此溶液浓度为 200 g/mL,置 2 8 冰箱保存，保质期 3 个月； 3) 维生素B 6标准贮备溶液：准确称取维生素B6 标准品 0.0200 g于 100 mL棕色容量瓶中，加 水溶解， 超声15 min， 待全部溶解后，用水定容至刻度， 此溶液浓度为 200 g/mL,置2 8 冰箱保存，保质期 3 个月； 4) 烟酰胺标准贮备溶液：准确称取烟酰胺标准品 0.0200 g 于 100 mL 棕色容量瓶，用水溶解、 定容至刻度,此溶液浓度为 200 g/mL,置 2 8 冰箱保存，保质期 3个月。 m) 混合标准工作溶液，操作步骤如下： 1) 分别准确移取维生素B 1、维生素
7、B2、维生素B 6、烟酰胺的标准贮备溶液 10.00 mL于同一 100 mL棕色容量瓶中，用 0.1三氟乙酸溶液定容。该溶液浓度为 20 g/mL，现用现配； 2) 准确移取上述混合标准溶液 2.5 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL于 100 mL棕色容量瓶中， 用 0.1三氟乙酸溶液稀释至 100 mL。该标准系列中维生素B 1、维生素B 2、维生素B 6、烟 酰胺的相应浓度分别为:0.50 g/mL、1.00 g/mL、2.00 g/mL、5.00 g/mL、10.00 g/mL， 现用现配。 5 仪器和设备 仪器和设备主要包括： a) 高效液相色谱仪：配有紫外检测器；
8、 b) 分析天平：感量 0.1 mg； c) 超声波清洗器：可加热至 80； d) 离心机：转速大于 4000 r/min； e) 针头过滤器：备 0.45 m（或 0.2 m ）滤膜。 6 试样的制备 选取有代表性饲料样品至少500 g，按GB/T 20 195 制备样品，全部通过孔径为0.45 mm的试验筛， 混匀。装入密闭容器中保存。 7 分析步骤 7.1 提取 准确称取试料适量 (维生素预混合饲料0.25 g0.5 g，复合预混合饲料1g5g)，精确至0.0002 g， 置于100 mL容量瓶中，加入盐酸溶液50 mL，80水浴超声提取30min，中间振摇23次。用水定容，摇 匀，于离
9、心机上4000 r/min 离心5 min。取上清液适量过滤膜，待测。 对于维生素B 1、维生素B 2、维生素B 6和烟酰胺含量较高的饲料，可先取适量上清液，用水稀释，使 试样溶液中维生素最终浓度为0.5 g/mL20 g/mL。 DB37/T 21402012 3 7.2 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件主要包括： a) 色谱柱： C 18,150 mm4.6 mm，粒径5 m； b) 柱温:30 ； c) 流动相:梯度洗脱见表 1； d) 流速: 1.30 mL/min； e) 检测器: 紫外检测器； f) 检测波长: 280 nm； g) 进样量: 10 L。 表1 流动相梯度表 时间
10、（min） 乙腈（） 0.1%三氟乙酸溶液（） 0.00 0.0 100.0 0.70 0.0 100.0 5.00 3.0 97.0 6.00 15.0 85.0 11.00 20.0 80.0 11.50 90.0 10.0 15.50 90.0 10.0 16.00 0.0 100.0 20.00 0.0 100.0 7.3 测定 7.3.1 标准曲线的绘制 将混合标准工作溶液从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱仪，以维生素的浓度为横坐标，峰面 积为纵坐标，分别绘制维生素B 1、维生素B 2、维生素B 6和烟酰胺的工作曲线，并计算回归方程。 7.3.2 试样测定 将待测液注入高效液相色谱
11、仪，根据保留时间定性，以峰面积定量。 8 结果计算 试样中维生素B 1、维生素B 2、维生素B 6和烟酰胺的含量以质量分数 Xi计，数值以毫克每千克（mg/kg） 表示，按公式(1)计算，测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字： n m Vc X i i .(1) 式中： c i -标准曲线上查得的某种维生素浓度的数值，单位为微克每毫升（g /mL ）； V -试样提取时定容体积，单位为毫升（mL）； m -试料的质量，单位为克（g）； DB37/T 21402012 4 n -稀释倍数。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于两个测定值的算术平均值的10， 以大
12、 于这两个测定值的算术平均值的10情况不超过5为前提。 DB37/T 21402012 5 A A 附 录 A （资料性附录） 标准样品参考图谱 烟酰胺 - 2 . 4 6 2 维生素 B 1 - 3 . 814 维生素 B6 - 5 . 9 7 2 维生素 B 2 - 10 . 6 13 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035 分钟 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 图A.1 维生素B 1、维生素B 2、维生素B 6和烟酰胺混合样品图谱 _
