1、ICS 65.080 G 20 DB37 山东省地方标准 DB37/T 21212012 尿素中多肽含量的测定 2012-05-07 发布 2012-06-01 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 21212012 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由山东省化工行业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：山东省化工研究院、中化山东肥业有限公司。 本标准主要起草人：崔爱红、王瑞菲、李琳、祈新宇、于朋玲、刘丙勇、饶飞、邱娟。 DB37/T 21212012 1 尿素中多肽含量的测定 1 范围 本标准规定了尿素中多肽含量高效液相色谱测定的试验方法
2、。 本标准适用于尿素中多肽含量的测定。 本标准的检出限为3 g。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 HG/T 2843 化肥产品 化学分析常用标准滴定溶液、标准溶液、试剂溶液和指示剂溶液 3 方法原理 将尿素中的多肽（聚天门冬氨酸）水解成天门冬氨酸，在碱性条件下，天门冬氨酸与异硫氰酸苯酯 反应，采用反相液相色谱法进行多肽含量（以天门冬氨酸计）的测定，外标法定量。 4 仪器设备 仪器设备包括： a)
3、高效液相色谱仪：带紫外检测器； b) 超声波清洗器； c) 压力蒸汽器：额定压力为 0.14 Mpa； d) 恒温水浴锅； e) 旋转蒸发仪； f) 分析天平：感量 0.0001 g； g) 水解管：50 mL； h) 针头过滤器：带 0.45 m 有机相过滤膜。 5 试剂和溶液 5.1 本标准所用试剂在没有注明其他要求时，均使用分析纯试剂；色谱流动相的配制使用 GB/T 6682 规定的一级水，其他使用三级水。 5.2 试验中所用制剂及制品、试剂溶液在没有注明其他要求时，均按 HG/T 2843 的规定制备。 5.3 试剂和溶液主要包括： a) 甲醇：色谱纯； DB37/T 21212012
4、 2 b) 三乙胺； c) 正己烷； d) 盐酸； e) 异硫氰酸苯酯-甲醇溶液：移取 1.2 mL 异硫氰酸苯酯，溶于 100 mL 甲醇中。此溶液室温下可 保存一周； f) 盐酸溶液：c（HCl）0.1 mol/L； g) 氨水溶液：1+4； h) 乙酸铵溶液：c（CH3COONH4）0.05 mol/L，pH 6.06.5。称取 1.93 g 乙酸铵加入 500 mL 水溶解，用氨水溶液调节 pH 为 6.06.5，经 0.45 m 滤膜过滤，于超声波清洗器中超声脱气 30 min； i) 苯酚：称取 100 g 苯酚于 250 mL 蒸馏烧瓶中，连接旋转蒸发仪，调节真空度约为 0.5
5、MPa， 加热蒸馏，收集馏出的苯酚，现用现蒸； j) 天门冬氨酸标准储备液（1.0 mg/mL）：称取天门冬氨酸 0.1 g（精确到 0.0002 g）于 50 mL 烧杯中，加盐酸溶液溶解，转移至 100 mL 容量瓶中，用盐酸溶液（定容至刻度。此标准储备 液于 4 下可保存两周； k) 天门冬氨酸标准工作溶液（100 g/mL）：移取 5.00 mL 天门冬氨酸标准储备液，置于 50 mL 容量瓶中，用盐酸溶液定容至刻度，摇匀，现用现配。 6 分析步骤 6.1 天门冬氨酸标准系列的制备 按表1所示，分别移取0.00 mL，0.10 mL，0.2 0 mL，0.40 mL，0. 60 mL，
6、0.80 mL天门冬氨酸标 准 工作溶液置于6个10 mL具塞试管中，加盐酸溶液至1.00 mL，加入1 mL 三乙胺、1.5 mL异硫氰酸苯酯- 甲醇溶液，加甲醇至5 mL，置于50 水浴中加热反应1 h。冷却至室温，加入3 mL正己烷，振摇2 min， 静置10 min后弃去上层溶液，再加入3 mL正己烷，振摇 2 min，静置10 min后弃去上层溶液，用注射器 取下层溶液1 mL，用针头过滤器过滤，备用。 表1 天门冬氨酸标准系列 天门冬氨酸标准溶液体积，mL 对应的天门冬氨酸质量，g 0.00 a 0 0.10 10 0.20 20 0.40 40 0.60 60 0.80 80 a
7、 试剂空白溶液 6.2 试验溶液的制备 称取试样2 g3 g准确至0.0002 g，以含多肽（以天门冬氨酸计）1 mg2 mg为宜，置于水解管 中，加入20 mL盐酸，0.3 g苯酚，放入压力蒸汽 器内，待到额定压力时开始计时，水解1.5 h。冷却后 将试液转移至蒸发皿中，于沸水浴上蒸干。沿蒸发皿壁加入10 mL盐酸溶液，于沸水浴上搅拌至固体全 DB37/T 21212012 3 部溶解后，将试液转移至25 mL容量瓶中，冷却至室温后用盐酸溶液定容至刻度，摇匀备用。此为试验 溶液A。 移取试验溶液A 1.00 mL于10 mL具塞试管中，加 入1 mL三乙胺、1.5 mL异硫氰酸苯酯-甲醇溶液
8、， 加甲醇至5 mL，置于50 水浴中加热反应1 h。冷却至室温，加入3 mL正己烷，振摇2 min，静置10 min 后弃去上层溶液，再加入3 mL正己烷，振摇2 min，静置10 min后弃去上层溶液，用注射器取下层溶液1 mL，用针头过滤器过滤，得试验溶液B。 6.3 高效液相色谱参考分析条件 6.3.1 高效液相色谱参考分析条件如下： a) 色谱柱：C18 柱，250 mm4.6 mm（i.d）； b) 流动相：甲醇乙酸铵溶液1585； c) 流速：1.0 mL/min； d) 柱温：室温； e) 波长：248 nm； f) 进样量：5 L。 6.4 典型高效液相色谱图见附录 A。 7
9、 定量测定 7.1 标准曲线的绘制 进样5 L测定标准系列溶液，以测得的峰高或峰面积与其对应的天门冬氨酸质量（g）绘制标准 曲线或求得线性回归方程。 7.2 试样的测定 在与测定标准系列溶液的相同操作条件下进样5 L进行试验溶液B的测定，根据测得的峰高或峰面 积，由标准曲线或线性回归方程得试验溶液中天门冬氨酸质量（g）。 8 结果计算 多肽（以天门冬氨酸计）的质量分数 w，数值以%表示，按式(1)计算： 100 1 10 6 1 = Vm m . (1) 式中： m1 由标准曲线上查得的试验溶液中天门冬氨酸质量的数值，单位为微克（g）； m 试样质量的数值，单位为克（g）； V 定容体积。 注： 取平行测定结果的算术平均值为测定结果，保留一位有效数字。 9 允许差 DB37/T 21212012 4 平行测定结果的相对偏差不大于10 %。 DB37/T 21212012 5 A A 附 录 A （资料性附录） 典型高效液相色谱图 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min 0 25 50 75 mV 1 2 3 4 5 6 7 说明： 1未知物； 2未知物； 3天冬氨酸衍生物； 4未知物； 5未知物； 6未知物； 7未知物。 图A.1 尿素样品谱图 _
